قمنا بتفصيل بروتوكول لإنشاء نظام 3D باستخدام مقاييس خارج الخلية جنبا إلى جنب مع الكولاجين واحد لتحليل التكوين والتعبير الجيني من خلال تكوين العظام. يمكن أن تزيد المقاييس خارج الخلية من شفافية هلام الكولاجين أحادي الشكل وهي مناسبة لاستكشاف تكوين التغصنات لتقنيات التصوير. لبدء ماصة ببطء 0.9 ملليلتر من مصفوفة الغشاء القاعدي في أنبوب طرد مركزي جديد 15 ملليلتر على الجليد والاحتفاظ به جانبا.
بعد ذلك ، قم بإزالة خيط T25 من الخلايا المستزرعة IDG SW3 في أربعة ملليلتر من الوسط الكامل المكمل بجاما الإنترفيرون من الحاضنة. بعد إزالة وسط الثقافة ، اغسل الخلايا باستخدام PBS pH 7.4 باستخدام ماصة. ثم التربسانة الخلايا مع 0.5 ملليلتر من 0.25 ٪ التربسين EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
تعطيل التربسين بإضافة 3.5 ملليلتر من الوسط الكامل. نقل أربعة ملليلتر من المعاش المئوي إلى أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر. أدر معلق الخلية عند 300 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات سلزية.
بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق لوحة الخلايا في ملليلتر واحد من الوسط الكامل على الجليد. عد الخلايا باستخدام مقياس خلوي دموي واضبط كثافة الخلية النهائية مع الوسط الكامل إلى أربعة في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر. أضف 0.1 ملليلتر من معلق الخلية المحضر إلى 0.9 ملليلتر من المصفوفة خارج الخلية المحفوظة على الجليد.
تخلط جيدا عن طريق سحب بلطف لأعلى ولأسفل. امزج برفق ملليلتر واحد من خليط مصفوفة الخلية ومليلتر واحد من الكولاجين المحضر مسبقا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل على الجليد. ماصة 0.5 ملليلتر من الخليط النهائي في كل بئر من صفيحة بئر 24 واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لتشكيل خليط هلام الخلية.
بعد الحضانة ، أضف 0.5 مل من الوسط العظمي إلى خليط هلام الخلية في كل بئر. لبدء التمايز العظمي عند 37 درجة سلزية، اعتبر هذا اليوم صفرا. كل يومين ، استبدل نصف الوسط بوسط عظمي جديد واستمر في الزراعة لمدة 35 يوما.
قم بإزالة محاليل الكالسيوم AM و ethidium one Stock من الفريزر واتركها تسخن إلى درجة حرارة الغرفة. أضف أربعة ميكرولترات من محلول مخزون واحد من الإيثيديوم المليمولي وخمسة ميكرولترات من محلول مخزون الكالسيوم AM بأربعة مليمولار إلى مليلتر من DPBS واخلطه جيدا للحصول على اثنين من ميكرومولار الكالسيوم AM وأربعة ميكرومولار إيثيديوم واحد كحل عملي. لأداء تلطيخ الخلايا في اليوم الأول واليوم السابع من الزراعة ، ماصة 0.5 ملليلتر من محلول العمل في آبار صفيحة البئر 24 واحتضانها لمدة 30 إلى 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتلطيخ مصفوفة هلام الخلية.
أضف ما يقرب من 0.5 ملليلتر من DPBS الطازج إلى طبق استزراع زجاجي جديد بطول 35 مم وقم بتغطية الطبق لمنع تلوث العينات أو تجفيفها. باستخدام ملقط الكوع المائل ، انقل بعناية مصفوفة هلام الخلايا الملطخة إلى طبق الاستزراع المحتوي على DPBS دون إتلاف أو قص مصفوفة هلام الخلية. عرض الخلايا المسمى تحت المجهر الفلوري متحد البؤر بالليزر.
ضع طبق الاستزراع الذي يحتوي على مصفوفة هلام الخلايا الملطخة على مرحلة المجهر. حدد مناطق مصفوفة هلام الخلية المراد مسحها ضوئيا من خلال العدسة باستخدام هدف 10x. لضبط المسح المجهري ، حدد المرشحات البصرية.
عرض الكالسيوم باللون الأخضر مع مرشح تمرير شريط الفلورسنت القياسي والإيثيديوم باللون الأحمر مع مرشحات ليوديد البروبيديوم أو صبغة تكساس الحمراء. حدد وضع الخط للمسح الضوئي ، ثم انقر فوق وضع الاستحواذ لضبط الوحدات جيدة التهوية على وحدة واحدة au. حدد عمق بيانات 8 بت ودقة صورة 1024 × 1024 بكسل.
ثم حدد خطوة الخط واضبط سرعة المسح على خمسة. لجمع مجموعة Z من الصور ، حدد المواضع العلوية والسفلية لمصفوفة هلام الخلية المراد مسحها ضوئيا من خلال التركيز خلال العينة أثناء المسح المستمر وفقا لإشارة القناة الخضراء. بمجرد تحديد الجزء العلوي والسفلي من العينة ، حدد إطار المسح المطلوب وابدأ المسح.
يتم مسح العينة ضوئيا من أعلى إلى أسفل مع الإعدادات المحددة لإنشاء معرض للصور. لتحديد الخلايا القابلة للحياة، حدد شريحة صورة واحدة. تشير القنوات الخضراء والحمراء إلى الخلايا الحية والميتة على التوالي.
لتحديد تغصنات الخلية ، حدد القناة الخضراء المفردة لإنشاء عمليات إعادة بناء 3D باستخدام برنامج الحصول على الصور ، وتشير سلسلة من الصور الملونة الزائفة لقوس قزح إلى معلومات العمق. يتم عرض الزوائد الشجيرية في الجزء السفلي باللون الأحمر ، بينما يتم عرض تلك الموجودة في الجزء العلوي باللون الأزرق. في أيام مختلفة من الزراعة ، قم بإزالة وسط الثقافة وغسل المواد الهلامية في الطبق مرتين باستخدام DPBS.
أضف 0.5 ملليلتر أو 4٪ بارافورمالدهيد في DPBS إلى البئر لإصلاح مصفوفة هلام الخلية في اللوحة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة paraformaldehyde في البئر وغسل مصفوفة هلام الخلية مرتين أخريين مع DPBS في اللوحة كما هو موضح سابقا ، واترك 0.5 ملليلتر من DPBS في كل بئر للتصوير. ضع اللوحة على مرحلة مجهر الاستريو وحدد الموضع الأمثل من خلال العدسة باستخدام هدف 0.5x.
الصورة ، عرض الحقل الكامل لمصفوفة هلام الخلية في اللوحة بشكل فردي باستخدام التعرض التلقائي تحت الحقل الساطع. في اليوم 35 من الزراعة ، تحقق من مستويات النيتروجين السائل وابدأ نظام XRF. افتح غرفة العينة وانقل المواد الهلامية باستخدام ملقط مائل بالكوع من اللوحة إلى منتصف مرحلة العينة للأداة.
أغلق غرفة العينة وانتظر لمدة 30 دقيقة للسماح للأداة بالتبريد قبل الاستخدام. اضبط وقت التعرض على 35 مللي ثانية. يتراوح الطيف من صفر إلى 40 كيلو إلكترون فولت والتيار الكهربائي إلى 770 ميكروأمبير للاستحواذ.
نقل مرحلة العينة ، اختر ثلاثة إلى خمسة مواقع مسح للتحليل. حدد عناصر الكالسيوم والفوسفور. ابدأ الكشف وتصدير النتائج.
في أيام مختلفة من الثقافة. اغسل مصفوفة هلام الخلية التي تمت إزالتها من وسط الاستزراع مرتين باستخدام DPBS البارد المثلج كما هو موضح سابقا. استخرج إجمالي الحمض النووي الريبي من مصفوفة هلام الخلية باستخدام طريقة كحول أيزو أميل كلوروفورم الفينول.
ثم قم بنسخ 2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي إلى CDNA باستخدام بادئات سداسية عشوائية. ضع الأنبوب على جهاز تدوير حراري وقم بإجراء تضخيم PCR. بعد تحليل PCR التغييرات طية مع اثنين من طريقة دلتا CT.
أظهر تلطيخ الخلايا الميتة الحية الذي تم تصوره تحت مجهر ليزر متحد البؤر أن جميع الخلايا كانت إيجابية الكالسيوم AM ولا توجد خلايا إيجابية تقريبا من الإيثيديوم يشير إلى أن نظام الهلام مناسب للغاية لتكوين الخلايا العظمية. امتدت الزوائد الشجيرية الخلوية تدريجيا إلى شبكة في الوسط العظمي بحلول اليوم السابع. صورة ملونة زائفة لثقافة اليوم السابع تعرض androids الخلية على أعماق مختلفة في الجزء السفلي والعلوي من الهلام.
يتم تصوير صور ميدانية كاملة للهلام مع الخلايا والهلام بدون خلايا في صفيحة بئر 24 في الأوقات المحددة. استمرت شفافية مصفوفة الهلام في الانخفاض حتى أصبحت معتمة في اليوم 35 على عكس مصفوفة الهلام الخالية من الخلايا. أشار طيف XRF للهلام غير الشفاف في اليوم 35 إلى أن الجل كان مملوءا بالكامل برواسب الكالسيوم والفوسفور.
أظهر التعبير عن العديد من جينات العلامات التي تم تحليلها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي أن مستويات mRNA من بودوبلانين وبروتين مصفوفة العاج واحد زادت باستمرار من اليوم الأول حتى اليوم 21 وانخفض مستوى mRNA بعد اليوم 21. زادت مستويات mRNA لعامل نمو الخلايا الليفية 23 والصلبة باستمرار خلال جميع المراحل. الكولاجين واحد ومقاييس الغشاء القاعدي هلام بسرعة ودرجة حرارة الغرفة.
لذلك ، يجب تبريد جميع الأطراف والأنابيب المستخدمة مسبقا ما لم يذكر خلاف ذلك. يمكن للمرء أن يلاحظ أي أحداث مثيرة للاهتمام أثناء تكوين العظم عن طريق تقنيات التصوير. من الأسهل توطين عمل الجزيء أثناء تكوين الزوائد الشجيرية والاستطالة.
