Nous avons détaillé un protocole pour établir un système 3D utilisant une métrique extracellulaire ainsi qu’une métrique de collagène pour analyser la formation et l’expression des gènes par ostéogenèse. Les mesures extracellulaires peuvent augmenter la transparence du gel de collagène sous forme unique et conviennent à l’exploration de la formation de dendrites pour les techniques d’imagerie. Pour commencer, pipetez lentement 0,9 millilitre de matrice de membrane basale dans un nouveau tube à centrifuger de 15 millilitres sur de la glace et gardez-le de côté.
Ensuite, retirez un fil dentaire T25 de cellules cultivées IDG SW3 dans quatre millilitres de milieu complet complété par de l’interféron gamma de l’incubateur. Après avoir retiré le milieu de culture, laver les cellules avec du PBS pH 7,4 à l’aide d’une pipette. Ensuite, trypsaniser les cellules avec 0,5 millilitre d’EDTA de trypsine à 0,25% à 37 degrés Celsius pendant 30 secondes.
Inactiver la trypsine en ajoutant 3,5 millilitres de milieu complet. Transférez quatre millilitres de la pension Celsius dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Faites tourner la suspension cellulaire à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Après avoir éliminé le surnageant, remettre en suspension la palette cellulaire dans un millilitre du milieu complet sur glace. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ajustez la densité cellulaire finale avec le milieu complet à quatre fois 10 à la cinquième cellule par millilitre. Ajouter 0,1 millilitre de la suspension cellulaire préparée aux 0,9 millilitre de la matrice extracellulaire conservée sur la glace.
Bien mélanger en pipetant doucement de haut en bas. Mélangez délicatement un millilitre du mélange de matrice cellulaire et un millilitre de collagène préalablement préparé en pipetant de haut en bas sur la glace. Pipeter 0,5 millilitre du mélange final dans chaque puits d’une plaque à 24 puits et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure pour former un mélange de gel cellulaire.
Après incubation, ajoutez 0,5 millilitre de milieu ostéogénique au mélange de gel cellulaire dans chaque puits. Pour commencer la différenciation ostéogénique à 37 degrés Celsius, considérez cela comme le jour zéro. Tous les deux jours, remplacez la moitié du milieu par du milieu ostéogénique frais et poursuivez la culture pendant 35 jours.
Sortez les solutions mères de calcium AM et d’éthidium du congélateur et laissez-les se réchauffer à température ambiante. Ajouter quatre microlitres de la solution mère d’éthidium à deux millimolaires et cinq microlitres de la solution mère de quatre millimolaires de calcium AM à deux millilitres de DPBS et bien mélanger pour obtenir deux micromolaires de calcium AM et quatre micromolaires d’éthidium comme solution de travail. Pour effectuer la coloration cellulaire le premier et le septième jour de culture, pipetez 0,5 millilitre de la solution de travail dans les puits de la plaque à 24 puits et incubez pendant 30 à 45 minutes à température ambiante pour colorer la matrice de gel cellulaire.
Ajouter environ 0,5 millilitre de DPBS frais dans une nouvelle boîte de culture à fond en verre de 35 millimètres et couvrir la boîte pour éviter la contamination ou le dessèchement des échantillons. À l’aide d’une pince à pointe coudée, transférez soigneusement la matrice de gel cellulaire colorée dans la boîte de culture contenant du DPBS sans endommager ni cisailler la matrice de gel cellulaire. Visualisez les cellules marquées sous un microscope à fluorescence confocale laser.
Placez la boîte de culture contenant la matrice de gel cellulaire colorée sur la platine du microscope. Sélectionnez les régions de la matrice de gel cellulaire à scanner à travers l’oculaire à l’aide d’un objectif 10x. Pour régler le balayage du microscope, sélectionnez les filtres optiques.
Considérez le calcium comme vert avec un filtre passe-bande fluorescent standard et l’éthidium comme rouge avec des filtres pour l’iodure de propidium ou le colorant rouge du Texas. Sélectionnez le mode ligne pour la numérisation, puis cliquez sur le mode d’acquisition pour régler les unités aérées sur une ua. Sélectionnez une profondeur de données de 8 bits et une résolution d’image de 1024 x 1024 pixels.
Sélectionnez ensuite le pas de ligne et réglez la vitesse de numérisation sur cinq. Pour collecter la pile Z d’images, définissez les positions supérieure et inférieure de la matrice de gel cellulaire à numériser en faisant la mise au point sur l’échantillon tout en balayant en continu en fonction du signal du canal vert. Une fois que le haut et le bas de l’échantillon ont été spécifiés, sélectionnez le cadre de numérisation souhaité et lancez la numérisation.
L’échantillon est numérisé de haut en bas avec les paramètres sélectionnés générant une galerie d’images. Pour identifier les cellules viables, sélectionnez une tranche d’image. Les canaux vert et rouge indiquent respectivement les cellules vivantes et mortes.
Pour identifier la dendrite de la cellule, sélectionnez le canal vert unique pour générer des reconstructions 3D avec le logiciel d’acquisition d’images, une série d’images pseudo-couleurs arc-en-ciel indiquent les informations de profondeur. Les dendrites en bas sont affichées en rouge, tandis que celles en haut sont affichées en bleu. À différents jours de culture, retirez le milieu de culture et lavez les gels dans la plaque deux fois avec du DPBS.
Ajouter 0,5 millilitre ou 4 % de paraformaldéhyde dans le DPBS dans le puits pour fixer la matrice de gel cellulaire dans la plaque pendant 10 minutes à température ambiante. Retirez le paraformaldéhyde dans le puits et lavez la matrice de gel cellulaire deux fois de plus avec du DPBS dans la plaque comme démontré précédemment, et laissez 0,5 millilitre de DPBS dans chaque puits pour l’imagerie. Placez la plaque sur la platine du stéréomicroscope et sélectionnez la position optimale à travers l’oculaire à l’aide d’un objectif 0,5x.
Image, la vue du champ complet de la matrice de gel cellulaire dans la plaque individuellement à l’aide d’une exposition automatique sous le champ clair. Au 35e jour de culture, vérifiez les niveaux d’azote liquide et démarrez le système XRF. Ouvrez la salle d’échantillonnage et transférez les gels à l’aide d’une pince à pointe coudée de la plaque au milieu de la platine d’échantillonnage de l’instrument.
Fermez la salle d’échantillonnage et attendez 30 minutes pour permettre à l’instrument de refroidir avant de l’utiliser. Réglez le temps d’exposition sur 35 millisecondes. La gamme de spectre va de zéro à 40 kilo-électronvolts et le courant électrique à 770 microampères pour la configuration de l’acquisition.
En déplaçant la platine de l’échantillon, choisissez trois à cinq sites de numérisation pour l’analyse. Sélectionnez les éléments calcium et phosphore. Lancez la détection et exportez les résultats.
À différents jours de culture. Lavez la matrice de gel cellulaire retirée du milieu de culture deux fois avec du DPBS glacé comme démontré précédemment. Extraire l’ARN total de la matrice du gel cellulaire à l’aide de la méthode de l’alcool isoamylique au chloroforme phénolique.
Ensuite, transcrivez inversement deux microgrammes d’ARN total en CDNA avec des amorces hexamères aléatoires. Placez le tube sur un thermocycleur et effectuez une amplification PCR. Après PCR, analysez les changements de pli avec la méthode de TDM à deux deltas.
La coloration des cellules mortes vivantes visualisée au microscope laser confocal a montré que toutes les cellules étaient positives pour le calcium AM et presque pas pour l’éthidium 1, ce qui indique que le système de gel est très approprié pour l’ostéocytogenèse. Les dendrites cellulaires se sont progressivement étendues en un réseau dans le milieu ostéogénique au septième jour. Une image pseudo couleur de la culture du septième jour montre les androïdes cellulaires à différentes profondeurs en bas et en haut du gel.
Des images plein champ du gel avec des cellules et du gel sans cellules dans une plaque à 24 puits aux moments indiqués sont imagées. La transparence de la matrice de gel a continué à diminuer jusqu’à ce qu’elle devienne opaque au jour 35, contrairement à la matrice de gel acellulaire. Le spectre XRF du gel opaque au jour 35 indiquait que le gel était complètement rempli de dépôts de calcium et de phosphore.
L’expression de plusieurs gènes marqueurs analysés par PCR en temps réel a montré que les niveaux d’ARNm de la podoplanine et de la protéine de la matrice dentine ont continuellement augmenté du premier jour au jour 21 et que le niveau d’ARNm a diminué après le jour 21. Les niveaux d’ARNm du facteur de croissance des fibroblastes 23 et de la sclérostine ont continuellement augmenté au cours de toutes les étapes. Collagen one et la membrane basale se gélifient rapidement et à température ambiante.
Par conséquent, tous les embouts et tubes utilisés doivent être pré-refroidis, sauf indication contraire. On peut observer tous les événements intéressants au cours de l’ostéogenèse par des techniques d’imagerie. Il est plus facile de localiser l’action de la molécule lors de la formation et de l’élongation des dendrites.
