Wir haben ein Protokoll zur Etablierung eines 3D-Systems unter Verwendung einer extrazellulären Metrik zusammen mit Kollagen zur Analyse der Bildung und Genexpression durch Osteogenese detailliert beschrieben. Extrazelluläre Metriken können die Transparenz des Kollagen-One-Form-Gels erhöhen und eignen sich für die Untersuchung der Dendritenbildung für bildgebende Verfahren. Um zu beginnen, pipettieren Sie langsam 0,9 Milliliter Basalmembranmatrix in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf Eis und legen Sie es beiseite.
Als Nächstes wird eine T25-Zahnseide aus IDG SW3-Zellen in vier Millilitern des vollständigen Mediums, das mit Interferon-Gamma ergänzt wurde, aus dem Inkubator entnommen. Nach dem Entfernen des Kulturmediums werden die Zellen mit PBS pH 7,4 mit einer Pipette gewaschen. Dann werden die Zellen mit 0,5 Millilitern 0,25%iger Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius für 30 Sekunden trypsanisiert.
Inaktivieren Sie Trypsin durch Zugabe von 3,5 Millilitern des vollständigen Mediums. Übertragen Sie vier Milliliter der Celsius-Rente in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Schleudern Sie die Zellsuspension bei 300 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius herunter.
Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie die Zellpalette in einem Milliliter des kompletten Mediums auf Eis. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und stellen Sie die endgültige Zelldichte mit dem kompletten Medium auf viermal 10 bis die fünften Zellen pro Milliliter ein. Zu den 0,9 Millilitern der auf Eis gehaltenen extrazellulären Matrix werden 0,1 Milliliter der vorbereiteten Zellsuspension gegeben.
Gut mischen, indem man vorsichtig auf und ab pipettiert. Mischen Sie vorsichtig einen Milliliter der Zellmatrixmischung und einen Milliliter des zuvor zubereiteten Kollagens, indem Sie auf dem Eis auf und ab pipettieren. Pipettieren Sie 0,5 Milliliter der Endmischung in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, um eine Zellgelmischung zu bilden.
Nach der Inkubation werden in jeder Vertiefung 0,5 Milliliter osteogenes Medium in die Zellgelmischung gegeben. Um die osteogene Differenzierung bei 37 Grad Celsius zu beginnen, betrachten Sie dies als Tag Null. Ersetzen Sie alle zwei Tage die Hälfte des Mediums durch frisches osteogenes Medium und setzen Sie die Kultivierung 35 Tage lang fort.
Nehmen Sie die Kalzium-AM- und Ethidium-Stammlösungen aus dem Gefrierschrank und lassen Sie sie auf Raumtemperatur erwärmen. Man fügt vier Mikroliter der zwei Millimolaren Ethidium-Stammlösung und fünf Mikroliter der vier Millimolaren Calcium-AM-Stammlösung zu zwei Millilitern DPBS hinzu und mischt gut, um zwei mikromolare Calcium-AM- und vier Mikromol-Ethidium-Stammlösung als Arbeitslösung zu erhalten. Um die Zellfärbung am ersten und siebten Tag der Kultivierung durchzuführen, pipettieren Sie 0,5 Milliliter der Arbeitslösung in die Vertiefungen der 24-Well-Platte und inkubieren Sie 30 bis 45 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Zellgelmatrix zu färben.
Geben Sie ca. 0,5 Milliliter frisches DPBS in eine neue 35-Millimeter-Kulturschale mit Glasboden und decken Sie die Schale ab, um eine Kontamination oder Austrocknung der Proben zu verhindern. Übertragen Sie die gefärbte Zellgelmatrix vorsichtig mit einer Ellbogenzange in die DPBS-haltige Kulturschale, ohne die Zellgelmatrix zu beschädigen oder zu scheren. Betrachten Sie die markierten Zellen unter einem konfokalen Laser-Fluoreszenzmikroskop.
Stellen Sie die Kulturschale mit der gefärbten Zellgelmatrix auf den Mikroskoptisch. Wählen Sie die Bereiche der Zellgelmatrix aus, die mit einem 10x-Objektiv durch das Okular abgetastet werden sollen. Um die Abtastung des Mikroskops einzustellen, wählen Sie die optischen Filter aus.
Betrachten Sie Kalzium als grün mit einem Standard-Fluoreszenz-Bandpassfilter und Ethidium als rot mit Filtern für Propidiumiodid oder texanischen roten Farbstoff. Wählen Sie den Zeilenmodus für das Scannen aus und klicken Sie dann auf den Erfassungsmodus, um die luftigen Einheiten auf eine Au einzustellen. Wählen Sie eine Datentiefe von 8 Bit und eine Bildauflösung von 1024 x 1024 Pixeln.
Wählen Sie dann den Zeilenschritt aus und stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf fünf ein. Um den Z-Stapel von Bildern zu erfassen, definieren Sie die obere und untere Position der zu scannenden Zellgelmatrix, indem Sie durch die Probe fokussieren, während Sie kontinuierlich gemäß dem grünen Kanalsignal scannen. Nachdem die Ober- und Unterseite der Probe festgelegt wurden, wählen Sie den gewünschten Scanrahmen aus und beginnen Sie mit dem Scannen.
Die Probe wird von oben nach unten gescannt, wobei die ausgewählten Einstellungen eine Bildergalerie erzeugen. Um die lebensfähigen Zellen zu identifizieren, wählen Sie einen Bildausschnitt aus. Der grüne und der rote Kanal zeigen lebende bzw. tote Zellen an.
Um den Zelldendriten zu identifizieren, wählen Sie den einzelnen grünen Kanal aus, um 3D-Rekonstruktionen mit der Bilderfassungssoftware zu erzeugen, eine Reihe von Regenbogen-Pseudofarbbildern zeigt die Tiefeninformation an. Die Dendriten am unteren Rand werden rot dargestellt, während die Dendriten am oberen Rand blau dargestellt werden. Entfernen Sie an verschiedenen Tagen der Kultivierung das Nährmedium und waschen Sie die Gele in der Platte zweimal mit DPBS.
Geben Sie 0,5 Milliliter oder 4 % Paraformaldehyd in DPBS in die Vertiefung, um die Zellgelmatrix 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in der Platte zu fixieren. Entfernen Sie das Paraformaldehyd in der Vertiefung und waschen Sie die Zellgelmatrix zwei weitere Male mit DPBS in der Platte, wie zuvor gezeigt, und lassen Sie 0,5 Milliliter DPBS in jeder Vertiefung für die Bildgebung. Legen Sie die Platte auf den Stereomikroskoptisch und wählen Sie mit einem 0,5-fach-Objektiv die optimale Position durch das Okular.
Bild, die Vollfeldansicht der Zellgelmatrix in der Platte einzeln unter Verwendung der automatischen Belichtung unter dem Hellfeld. Überprüfen Sie am 35. Tag der Kultivierung den Flüssigstickstoffgehalt und starten Sie das RFA-System. Öffnen Sie den Probenraum und übertragen Sie die Gele mit einer Ellbogenpinzette von der Platte in die Mitte des Probentisches des Instruments.
Schließen Sie den Probenraum und warten Sie 30 Minuten, damit das Gerät abkühlen kann, bevor Sie es verwenden. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 35 Millisekunden ein. Der Spektrumbereich reicht von null bis 40 Kiloelektronenvolt und der elektrische Strom bis 770 Mikroampere für die Erfassung.
Verschieben Sie den Probentisch und wählen Sie drei bis fünf Scanstellen für die Analyse aus. Wählen Sie die Elemente Kalzium und Phosphor aus. Starten Sie die Erkennung, und exportieren Sie die Ergebnisse.
An verschiedenen Kultivierungstagen. Waschen Sie die aus dem Kulturmedium entfernte Zellgelmatrix zweimal mit eiskaltem DPBS, wie zuvor gezeigt. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus der Zellgelmatrix mit der Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Methode.
Transkription dann zwei Mikrogramm Gesamt-RNA in CDNA mit zufälligen Hexamer-Primern. Legen Sie das Röhrchen auf einen Thermocycler und führen Sie eine PCR-Amplifikation durch. Nach der PCR analysieren Sie die Faltenveränderungen mit der Zwei-Delta-CT-Methode.
Die Färbung lebender toter Zellen, die unter einem konfokalen Lasermikroskop visualisiert wurde, zeigte, dass alle Zellen Calcium-AM-positiv und fast keine Ethidium-1-positiven Zellen waren, was darauf hindeutet, dass das Gelsystem sehr gut für die Osteozytogenese geeignet ist. Die zellulären Dendriten dehnten sich bis zum siebten Tag allmählich zu einem Netzwerk im osteogenen Medium aus. Ein Pseudo-Farbbild der Tag-Sieb-Kultur zeigt die Zellandroiden in unterschiedlichen Tiefen am unteren und oberen Rand des Gels.
Es werden Vollfeldbilder des Gels mit Zellen und des Gels ohne Zellen in einer 24-Well-Platte zu den angegebenen Zeitpunkten abgebildet. Die Transparenz der Gelmatrix nahm weiter ab, bis sie am Tag 35 im Gegensatz zur zellfreien Gelmatrix undurchsichtig wurde. Das RFA-Spektrum des trüben Gels an Tag 35 zeigte, dass das Gel vollständig mit Kalzium- und Phosphorablagerungen gefüllt war.
Die Expression mehrerer Markergene, die mittels real-time PCR analysiert wurden, zeigte, dass die mRNA-Spiegel von Podoplanin und Dentinmatrixprotein eins vom ersten Tag bis zum Tag 21 kontinuierlich anstiegen und der mRNA-Spiegel nach Tag 21 abnahm. Die mRNA-Spiegel des Fibroblasten-Wachstumsfaktors 23 und des Sclerostins stiegen in allen Stadien kontinuierlich an. Kollagen eins und die Basalmembran Metriken gelieren schnell und bei Raumtemperatur.
Daher müssen alle verwendeten Spitzen und Röhrchen vorgekühlt werden, sofern nicht anders angegeben. Man kann alle interessanten Ereignisse während der Osteogenese mit bildgebenden Verfahren beobachten. Es ist einfacher, die Molekülwirkung während der Dendritenbildung und -dehnung zu lokalisieren.
