Osteogenez yoluyla oluşum ve gen ekspresyonunu analiz etmek için kollajen ile birlikte hücre dışı ölçümler kullanarak bir 3D sistem kurmak için bir protokolü detaylandırdık. Hücre dışı metrikler, kollajen tek formlu jelin şeffaflığını artırabilir ve görüntüleme teknikleri için dendrit oluşumunu keşfetmek için uygundur. Yavaşça başlamak için, 0,9 mililitre bazal membran matrisini buz üzerinde 15 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne pipetleyin ve bir kenarda tutun.
Daha sonra, inkübatörden interferon gama ile takviye edilmiş dört mililitre tam ortamda IDG SW3 kültürlenmiş hücrelerin bir T25 ipini çıkarın. Kültür ortamını çıkardıktan sonra, hücreleri PBS pH 7.4 ile bir pipetle yıkayın. Daha sonra hücreleri 30 saniye boyunca 37 santigrat derecede 0.5 mililitre% 0.25 tripsin EDTA ile tripsanize edin.
3.5 mililitre tam ortam ekleyerek tripsini etkisiz hale getirin. Santigrat emekli maaşının dört mililitresini 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücre süspansiyonunu dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 G'de döndürün.
Süpernatanı attıktan sonra, hücre paletini buz üzerinde tam ortamın bir mililitresinde yeniden süspanse edin. Bir hemo sitometre kullanarak hücreleri sayın ve son hücre yoğunluğunu tam ortamla dört kez 10 ila mililitre başına beşinci hücreye ayarlayın. Buz üzerinde tutulan hücre dışı matrisin 0.9 mililitresine hazırlanan hücre süspansiyonunun 0.1 mililitresini ekleyin.
Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Bir mililitre hücre matris karışımını ve bir mililitre önceden hazırlanmış kolajeni buzun üzerine yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın. Son karışımın 0.5 mililitresini 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna pipetleyin ve bir hücre jeli karışımı oluşturmak için bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, her bir oyuktaki hücre jel karışımına 0.5 mililitre osteojenik ortam ekleyin. Osteojenik farklılaşmayı 37 santigrat derecede başlatmak için bunu sıfır gün olarak düşünün. Her iki günde bir, ortamın yarısını taze osteojenik ortamla değiştirin ve 35 gün boyunca kültüre devam edin.
Kalsiyum ve etidyum bir stok çözeltisini dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığına ısınmalarına izin verin. İki mililitre DPBS'ye dört mikrolitre iki milimolar etidiyum, bir stok çözeltisi ve beş mikrolitre dört milimolar kalsiyum stok çözeltisi ekleyin ve iki mikromolar kalsiyum ve dört mikromolar etidyum elde etmek için iyice karıştırın. Kültürün birinci ve yedinci gününde hücre boyama yapmak için, 0.5 mililitre çalışma solüsyonunu 24 oyuklu plakanın kuyucuklarına pipetleyin ve hücre jel matrisini boyamak için oda sıcaklığında 30 ila 45 dakika inkübe edin.
Yeni bir 35 milimetrelik cam tabanlı kültür kabına yaklaşık 0,5 mililitre taze DPBS ekleyin ve numunelerin kontaminasyonunu veya kurumasını önlemek için kabı kapatın. Dirsek uçlu forseps kullanarak, lekeli hücre jel matrisini, hücre jel matrisine zarar vermeden veya kesmeden dikkatlice DPBS içeren kültür kabına aktarın. Etiketli hücreleri bir lazer konfokal floresan mikroskobu altında görüntüleyin.
Lekeli hücre jeli matrisini içeren kültür kabını mikroskop tablasına yerleştirin. 10x objektif kullanarak göz merceğinden taranacak hücre jeli matrisinin bölgelerini seçin. Mikroskop taramasını ayarlamak için optik filtreleri seçin.
Kalsiyumu standart bir floresan bant geçiren filtreyle yeşil olarak ve etidiyumu propidyum iyodür veya Texas kırmızı boyası filtreleriyle kırmızı olarak görüntüleyin. Tarama için çizgi modunu seçin, ardından havadar birimleri bir au'ya ayarlamak için çekim moduna tıklayın. 8 bit veri derinliği ve 1024 x 1024 piksel görüntü çözünürlüğü seçin.
Ardından satır adımını seçin ve tarama hızını beş olarak ayarlayın. Z görüntü yığınını toplamak için, yeşil kanal sinyaline göre sürekli tarama yaparken örneğe odaklanarak taranacak hücre jel matrisinin üst ve alt konumlarını tanımlayın. Örneğin üst ve alt kısımları belirlendikten sonra, istediğiniz tarama çerçevesini seçin ve taramaya başlayın.
Örnek, seçilen ayarlarla yukarıdan aşağıya doğru taranır ve bir görüntü galerisi oluşturulur. Uygun hücreleri belirlemek için, bir görüntü dilimi seçin. Yeşil ve kırmızı kanallar sırasıyla canlı ve ölü hücreleri gösterir.
Hücre dendritini tanımlamak için, görüntü alma yazılımı ile 3D rekonstrüksiyonlar oluşturmak için tek yeşil kanalı seçin, bir dizi gökkuşağı sözde renkli görüntü derinlik bilgisini gösterir. Alttaki dendritler kırmızı renkte, üsttekiler ise mavi renkte gösterilir. Farklı kültür günlerinde, kültür ortamını çıkarın ve jelleri plakada DPBS ile iki kez yıkayın.
Hücre jeli matrisini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca plakaya sabitlemek için kuyucuğa DPBS'de 0.5 mililitre veya% 4 paraformaldehit ekleyin. Kuyucuktaki paraformaldehiti çıkarın ve hücre jeli matrisini daha önce gösterildiği gibi plakada DPBS ile iki kez daha yıkayın ve görüntüleme için her kuyucukta 0,5 mililitre DPBS bırakın. Plakayı stereo mikroskop tablasına yerleştirin ve 0.5x objektif kullanarak göz merceği boyunca en uygun konumu seçin.
Görüntü, parlak alan altında otomatik pozlama kullanılarak plakadaki hücre jeli matrisinin tam alan görünümü. Kültürün 35. gününde, sıvı nitrojen seviyelerini kontrol edin ve XRF sistemini başlatın. Numune odasını açın ve dirsek uçlu forseps ile jelleri plakadan cihazın numune aşamasının ortasına aktarın.
Numune odasını kapatın ve kullanmadan önce cihazın soğuması için 30 dakika bekleyin. Pozlama süresini 35 milisaniyeye ayarlayın. Spektrum aralığı sıfır ila 40 kilo elektron volt ve elektrik akımı 770 mikroamper edinim kurulumu için.
Örnek aşamayı hareket ettirerek, analiz için üç ila beş tarama alanı seçin. Kalsiyum ve fosfor elementlerini seçin. Algılamayı başlatın ve sonuçları dışa aktarın.
Farklı kültür günlerinde. Kültür ortamından çıkarılan hücre jeli matrisini daha önce gösterildiği gibi buz gibi soğuk DPBS ile iki kez yıkayın. Fenol kloroform izoamil alkol yöntemini kullanarak hücre jeli matrisinden toplam RNA'yı çıkarın.
Daha sonra iki mikrogram toplam RNA'yı rastgele heksamer primerleri ile CDNA'ya ters çevirin. Tüpü bir termodöngüleyiciye yerleştirin ve PCR amplifikasyonu gerçekleştirin. PCR sonrası iki delta CT yöntemi ile kıvrım değişikliklerini analiz edin.
Konfokal lazer mikroskobu altında görüntülenen canlı ölü hücre boyama, tüm hücrelerin kalsiyum pozitif olduğunu ve jel sisteminin osteositogenez için oldukça uygun olduğunu gösteren neredeyse hiç etidyum bir pozitif hücre olmadığını gösterdi. Hücresel dendritler, yedinci günde osteojenik ortamda yavaş yavaş bir ağa yayıldı. Yedinci gün kültürünün sahte renkli bir görüntüsü, hücre androidlerini jelin altında ve üstünde farklı derinliklerde görüntüler.
Belirtilen zamanlarda 24 oyuklu bir plakada hücreli ve hücresiz jelin tam alan görüntüleri görüntülenir. Jel matrisinin şeffaflığı, hücresiz jel matrisinin aksine 35. günde opak hale gelene kadar azalmaya devam etti. Opak jelin 35. gündeki XRF spektrumu, jelin tamamen kalsiyum ve fosfor birikintileri ile dolu olduğunu gösterdi.
Gerçek zamanlı PCR ile analiz edilen birkaç belirteç geninin ekspresyonu, podoplanin ve dentin matriks proteini birinin mRNA seviyelerinin birinci günden 21. güne kadar sürekli arttığını ve mRNA seviyesinin 21. günden sonra azaldığını gösterdi. Fibroblast büyüme faktörü 23 ve sklerostin mRNA seviyeleri tüm aşamalarda sürekli olarak artmıştır. Kollajen bir ve bazal membran metrikleri hızlı bir şekilde jelleşir ve oda sıcaklığı.
Bu nedenle, aksi belirtilmedikçe kullanılan tüm uçlar ve tüpler önceden soğutulmalıdır. Osteogenez sırasında herhangi bir ilginç olay görüntüleme teknikleri ile gözlemlenebilir. Dendrit oluşumu ve uzaması sırasında molekül etkisini lokalize etmek daha kolaydır.
