使用钙氟在苔藓中细胞壁动力学的 3-D 延时成像

使用荧光显微镜的延时成像可以观察细胞和亚细胞水平的生长和发育的动态变化。这种用于3D延时成像的简单方案可以直接长时间研究细胞壁动力学。该方案使用钙荧光染料来标记细胞壁厚度的动力学，因此不需要荧光蛋白的转化。

钙氟信号稳定，可持续一周以上。该方法可以应用于许多其他具有包含细胞壁的简单结构的系统，并且可以用钙荧光染色，例如在开花植物中。在该协议中，当该染料在整个延时成像过程中在培养基中混合时，钙荧光信号是稳定的。

首先，将七天大的苔藓组织分散到含有20微升灭菌水的1.5毫升微管中。对于野生型，使用镊子分离质子。对于ggb突变体，使用AP-1000移液管分离质子。

将 10 微升灭菌的钙荧光白加入微管中，并将管直立在罩中两分钟进行染色。染色后，立即用P1000移液管移液五次，将植物与含有BCDAT培养基的200微升冷却BCDATG混合，并将混合物转移到27毫米玻璃基培养皿中。确保将带有样品的200微升BCDATG均匀分布在27毫米玻璃底培养皿的表面上，以产生一层薄膜，使样品在成像过程中处于物镜工作距离内。

在室温下凝固两分钟后，用三毫升冷却的BCDATG覆盖薄层，静置10分钟以再次凝固。在盘子的底部，每条线以平行和垂直的方向绘制九条线，并用从A到H的字符标记行，用从1到8的数字标记列。使用上、下、右、中和左标记每个方块内的位置。

例如，如果植物位于第二行第六列的正方形中，并且位于正方形的左上角，则该植物的名称为左上角的 b6。将玻璃底培养皿置于白光下一到两天，然后每天进行延时成像，最多三天。要重建 3D 图像，请打开 ND2 文件并单击音量。

在第零天、第一天、第三天和第四天重建细胞壁。拍摄每张图像后，将玻璃基培养皿放回生长室。野生型和ggb突变体的钙荧光白色染色显示了横壁的动态变化。

对于ggb突变体，每个图像下方的白色虚线表示扩增细胞中的破碎表面细胞壁，橙色线表示ggb中细胞壁表面下方的细胞。可以在细胞的表面位置检测到钙荧光-白色信号的差异，并且染色密度较低的区域表明ggb突变体中的细胞扩增或野生型中的新分支位点。对于野生型预培养，由于钙荧光白可以与其他染料（如微球）一起使用，因此需要植物在上述弱红光下5天诱导质子的光向性响应，以便植物可以附着在培养皿的底部，并且可以在成像过程中在物镜向上工作距离内出现植物。

还可以研究有关细胞扩增的其他信息。植物细胞壁的动力学对于有效生长和发育以及对环境信号的响应至关重要。该协议允许直接分裂细胞壁信号的变化并进行整合。