Las imágenes de lapso de tiempo con microscopía de fluorescencia permiten observar los cambios dinámicos de crecimiento y desarrollo a nivel celular y subcelular. Este sencillo protocolo para imágenes de lapso de tiempo 3D puede estudiar directamente la dinámica de la pared celular durante un largo período. Este protocolo utiliza colorante calcofluor para marcar la dinámica del grosor de la pared celular y, por lo tanto, no requiere una transformación de una proteína fluorescente.
Las señales de calcofluor son estables y pueden durar más de una semana. Este método se puede aplicar a muchos otros sistemas con estructuras simples que contienen paredes celulares y puede ser teñido por calcofluor, como en las plantas con flores. En este protocolo, las señales de calcofluor son estables cuando este colorante se mezcla dentro del medio durante todo el proceso de imágenes de lapso de tiempo.
Para comenzar, disperse el tejido de musgo de siete días en un microtubo de 1,5 mililitros que contenga 20 microlitros de agua esterilizada. Para el tipo salvaje use fórceps para separar los protonemata. Para el mutante ggb, separe el protonemata usando pipeta AP-1000.
Agregue 10 microlitros del calcofluor-blanco esterilizado en el microtubo y deje el tubo en posición vertical en la campana durante dos minutos para teñir. Inmediatamente después de la tinción, mezcle las plantas con 200 microlitros de BCDATG enfriado que contenga medio BCDAT pipeteando cinco veces con una pipeta P1000 y transfiera la mezcla a un plato base de vidrio de 27 milímetros. Asegúrese de que los 200 microlitros de BCDATG con muestras se distribuyan uniformemente en la superficie del plato de fondo de vidrio de 27 milímetros para producir una capa delgada de película de modo que las muestras estén dentro de la distancia de trabajo objetivo durante la toma de imágenes.
Después de solidificar durante dos minutos a temperatura ambiente, cubra la capa delgada con tres mililitros de BCDATG enfriado y déjela reposar durante 10 minutos para que se solidifique nuevamente. En la parte inferior del plato, dibuje nueve líneas cada una en direcciones paralelas y perpendiculares y marque las filas con caracteres de la A a la H, y las columnas con números del uno al ocho. Use superior, inferior, derecha, medio e izquierda para marcar las posiciones dentro de cada cuadrado.
Por ejemplo, si una planta está en un cuadrado en la segunda fila, en la sexta columna y se coloca en la parte superior izquierda del cuadrado, entonces esta planta recibe el nombre de b6 superior izquierda. Coloque el plato con fondo de vidrio bajo luz blanca durante uno o dos días antes de ser sometido a imágenes de lapso de tiempo todos los días, hasta por tres días. Para reconstruir las imágenes 3D, abra el archivo ND2 y haga clic en volumen.
Reconstruya la pared celular en el día cero, el día uno, el día tres y el día cuatro. Después de tomar cada imagen, vuelve a colocar el plato a base de vidrio en la cámara de cultivo. Los cambios dinámicos en las paredes cruzadas se mostraron mediante tinción de blanco calcofluor en mutantes de tipo salvaje y ggb.
Para los mutantes ggb, las líneas discontinuas blancas debajo de cada imagen indican la pared celular de la superficie rota en las celdas en expansión y las líneas naranjas indican las celdas debajo de la superficie de la pared celular en ggb. Las diferencias en la señal de blanco calcofluorado se pueden detectar en las posiciones superficiales de las células y las regiones menos densamente teñidas indicaron expansión celular en mutantes ggb o sitios de nueva ramificación en el tipo salvaje. Para el precultivo de tipo silvestre, se requiere que las plantas en luz roja débil de lo anterior durante cinco días induzcan las respuestas fototrópicas de protonemata para que las plantas puedan adherirse al fondo de los platos y las plantas puedan emerger dentro de la distancia de trabajo ascendente objetiva durante la obtención de imágenes porque el blanco de calcofluor se puede usar con otro tinte como la microesfera.
También se puede estudiar información adicional sobre la expansión celular. La dinámica de la pared celular de la planta es fundamental para el crecimiento y desarrollo eficientes, así como para la respuesta a la señal ambiental. Este protocolo permite la división directa de los cambios en las señales de la pared celular y la integración.
