형광 현미경을 사용한 타임랩스 이미징을 통해 세포 및 세포하 수준에서 성장 및 발달의 동적 변화를 관찰할 수 있습니다. 3D 타임랩스 이미징을 위한 이 간단한 프로토콜은 장기간에 걸쳐 세포벽 역학을 직접 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포벽 두께의 역학을 표시하기 위해 calcofluor 염료를 사용하므로 형광 단백질의 변형이 필요하지 않습니다.
칼코플루오르 신호는 안정적이며 일주일 이상 지속될 수 있습니다. 이 방법은 세포벽을 포함하는 간단한 구조를 가진 많은 다른 시스템에 적용될 수 있으며 꽃 식물과 같이 calcofluor에 의해 염색 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서 칼코플루오르 신호는 타임랩스 이미징의 전체 과정에서 이 염료가 매체 내에서 혼합될 때 안정적입니다.
시작하려면 7 일 된 이끼 조직을 20 마이크로 리터의 멸균 된 물이 들어있는 1.5 밀리리터 마이크로 튜브에 분산시킵니다. 야생형의 경우 포셉을 사용하여 양성자를 분리하십시오. ggb 돌연변이의 경우 AP-1000 피펫을 사용하여 프로톤마타를 분리합니다.
멸균 된 칼코 플루오르 화이트 10 마이크로 리터를 마이크로 튜브에 넣고 염색을 위해 튜브를 후드에 2 분 동안 똑바로 세워 두십시오. 염색 직후, 식물을 P1000 피펫으로 5회 피펫팅하여 BCDAT 배지를 함유하는 200마이크로리터의 냉각된 BCDATG와 혼합하고 혼합물을 27밀리미터 유리 베이스 접시에 옮깁니다. 샘플이 포함 된 200 마이크로 리터의 BCDATG가 27mm 유리 바닥 접시의 표면에 고르게 분포되어 이미징 중에 샘플이 목표 작동 거리 내에 있도록 얇은 필름 층을 생성하는지 확인하십시오.
실온에서 2 분 동안 응고시킨 후, 냉각 된 BCDATG 3 밀리리터로 얇은 층을 덮고 다시 응고시키기 위해 10 분 동안 그대로 두십시오. 접시의 바닥에 평행하고 수직 인 방향으로 각각 9 개의 선을 그리고 행에는 A에서 H까지의 문자로, 열에는 1에서 8까지의 숫자로 표시합니다. 위, 아래, 오른쪽, 중간 및 왼쪽을 사용하여 각 사각형 내의 위치를 표시합니다.
예를 들어, 식물이 두 번째 행의 사각형, 여섯 번째 열에 있고 사각형의 왼쪽 상단에 위치하면이 식물에 b6 왼쪽 상단의 이름이 지정됩니다. 유리 바닥 접시를 백색광 아래에 1-2일 동안 두었다가 최대 3일 동안 매일 타임랩스 이미징을 받습니다. 3D 이미지를 재구성하려면 ND2 파일을 열고 볼륨을 클릭합니다.
0일째, 첫째 날, 셋째 날, 넷째 날에 세포벽을 재구성합니다. 각 이미지를 찍은 후 유리 기반 접시를 재배 챔버에 다시 넣습니다. 횡벽에서의 동적 변화는 야생형 및 ggb 돌연변이체에서의 칼코플루오르-화이트 염색에 의해 나타났다.
ggb 돌연변이의 경우 각 이미지 아래의 흰색 점선은 확장 세포의 깨진 표면 세포벽을 나타내고 주황색 선은 ggb의 세포벽 표면 아래에 있는 세포를 나타냅니다. 칼코플루오르-화이트 신호의 차이는 야생형에서 ggb 돌연변이체 또는 새로 분지된 부위에서 세포 확장을 나타내는 세포의 표면 위치 및 덜 조밀하게 염색된 부위에서 검출될 수 있다. 야생형 사전 배양의 경우, 프로톤마타의 광변성 반응을 유도하기 위해 5일 동안 위로부터 약한 적색광의 식물이 필요하므로 식물이 접시의 바닥에 부착될 수 있고 식물이 이미징 중에 객관적인 상향 작동 거리 내에서 나올 수 있기 때문에 calcofluor-white는 마이크로스피어와 같은 다른 염료와 함께 사용할 수 있습니다.
세포 확장에 대한 추가 정보도 연구 할 수 있습니다. 식물 세포벽의 역학은 효율적인 성장 및 발달뿐만 아니라 환경 신호에 대한 반응에도 중요합니다. 이 프로토콜은 세포벽 신호의 변화를 직접 분할하고 통합 할 수 있습니다.
