L'imaging time-lapse con microscopia a fluorescenza consente l'osservazione dei cambiamenti dinamici di crescita e sviluppo a livello cellulare e subcellulare. Questo semplice protocollo per l'imaging time-lapse 3D può studiare direttamente la dinamica della parete cellulare per un lungo periodo. Questo protocollo utilizza colorante calcofluor per marcare la dinamica dello spessore della parete cellulare e quindi non richiede una trasformazione di una proteina fluorescente.
I segnali calcofluor sono stabili e possono durare per più di una settimana. Questo metodo può essere applicato a molti altri sistemi con strutture semplici contenenti pareti cellulari e può essere colorato da calcofluor come nelle piante da fiore. In questo protocollo, i segnali calcofluor sono stabili quando questo colorante viene miscelato all'interno del mezzo durante l'intero processo di imaging time-lapse.
Per iniziare, disperdere il tessuto di muschio di sette giorni in un micro tubo da 1,5 millilitri contenente 20 microlitri di acqua sterilizzata. Per il tipo selvatico utilizzare una pinza per separare i protonemati. Per il mutante ggb, separare il protonemata usando la pipetta AP-1000.
Aggiungere 10 microlitri di calcofluor-bianco sterilizzato nel microtubo e lasciare il tubo in posizione verticale nel cappuccio per due minuti per la colorazione. Immediatamente dopo la colorazione, mescolare le piante con 200 microlitri di BCDATG raffreddato contenente mezzo BCDAT pipettando cinque volte con una pipetta P1000 e trasferire la miscela in una base di vetro da 27 millimetri. Assicurarsi che i 200 microlitri di BCDATG con i campioni siano distribuiti uniformemente sulla superficie del piatto inferiore in vetro da 27 millimetri per produrre un sottile strato di pellicola in modo che i campioni rientrino nella distanza di lavoro oggettiva durante l'imaging.
Dopo aver solidificato per due minuti a temperatura ambiente, coprire lo strato sottile con tre millilitri di BCDATG raffreddato e lasciarlo riposare per 10 minuti per solidificare di nuovo. Sul fondo del piatto disegna nove linee ciascuna in direzioni parallele e perpendicolari e segna le righe con caratteri da A a H e le colonne con numeri da uno a otto. Usa superiore, inferiore, destra, centro e sinistra per contrassegnare le posizioni all'interno di ogni quadrato.
Ad esempio, se una pianta si trova in un quadrato nella seconda fila, nella sesta colonna ed è posizionata nella parte in alto a sinistra del quadrato, a questa pianta viene dato il nome di b6 in alto a sinistra. Posizionare il piatto inferiore in vetro sotto la luce bianca per uno o due giorni prima di essere sottoposto a imaging time-lapse ogni giorno, per un massimo di tre giorni. Per ricostruire le immagini 3D aprire il file ND2 e fare clic su volume.
Ricostruisci la parete cellulare al giorno zero, al primo giorno, al terzo e al quarto giorno. Dopo aver scattato ogni immagine, rimetti il piatto a base di vetro nella camera di coltivazione. I cambiamenti dinamici nelle pareti trasversali sono stati mostrati dalla colorazione bianco calcofluor nei mutanti wild type e ggb.
Per i mutanti ggb, le linee tratteggiate bianche sotto ogni immagine indicano la parete cellulare della superficie rotta nelle celle in espansione e le linee arancioni indicano le celle sotto la superficie della parete cellulare in ggb. Le differenze nel segnale bianco calcofluor possono essere rilevate sulle posizioni superficiali delle cellule e le regioni meno densamente colorate indicano l'espansione cellulare nei mutanti ggb o nei siti di nuova ramificazione nel tipo selvatico. Per la precoltura di tipo selvatico, le piante in luce rossa debole dall'alto per cinque giorni sono necessarie per indurre le risposte fototropiche di protonemata in modo che le piante possano essere attaccate al fondo dei piatti e le piante possano essere emerse entro la distanza di lavoro dell'obiettivo durante l'imaging perché il bianco calcofluor può essere utilizzato con altri coloranti come la microsfera.
Ulteriori informazioni sull'espansione cellulare possono anche essere studiate. La dinamica della parete cellulare vegetale è fondamentale per una crescita e uno sviluppo efficienti, nonché per la risposta al segnale ambientale. Questo protocollo consente la divisione diretta dei cambiamenti nei segnali della parete cellulare e l'integrazione.
