A imagem de lapso de tempo com microscopia de fluorescência permite a observação das mudanças dinâmicas de crescimento e desenvolvimento nos níveis celular e subcelular. Este protocolo simples para imagens de lapso de tempo 3D pode estudar diretamente a dinâmica da parede celular durante um longo período. Este protocolo utiliza corante calcofluor para marcar a dinâmica da espessura da parede celular e, portanto, não requer uma transformação de uma proteína fluorescente.
Os sinais de calcofluor são estáveis e podem durar mais de uma semana. Este método pode ser aplicado a muitos outros sistemas com estruturas simples contendo paredes celulares e pode ser corado por calcofluor, como em plantas com flores. Neste protocolo, os sinais de calcofluor são estáveis quando este corante é misturado dentro do meio durante todo o processo de imagem de lapso de tempo.
Para começar, disperse o tecido de musgo de sete dias de idade em um microtubo de 1,5 mililitro contendo 20 microlitros de água esterilizada. Para o tipo selvagem use fórceps para separar os prótonos. Para o mutante ggb, separe os protonatos usando a pipeta AP-1000.
Adicione 10 microlitros do calcofluor-branco esterilizado no microtubo e deixe o tubo ereto no exaustor por dois minutos para colorir. Imediatamente após a coloração, misture as plantas com 200 microlitros de BCDATG resfriado contendo meio BCDAT pipetando cinco vezes com uma pipeta P1000 e transfira a mistura para um prato de base de vidro de 27 milímetros. Certifique-se de que os 200 microlitros de BCDATG com amostras sejam distribuídos uniformemente na superfície do prato de fundo de vidro de 27 milímetros para produzir uma fina camada de filme para que as amostras estejam dentro da distância de trabalho objetiva durante a imagem.
Depois de solidificar por dois minutos à temperatura ambiente, cubra a camada fina com três mililitros de BCDATG resfriado e deixe ajustar por 10 minutos para solidificar novamente. Na parte inferior do prato, desenhe nove linhas cada em direções paralelas e perpendiculares e marque as linhas com caracteres de A a H e as colunas com números de um a oito. Use superior, inferior, direita, meio e esquerda para marcar as posições dentro de cada quadrado.
Por exemplo, se uma planta está em um quadrado na segunda linha, na sexta coluna e está posicionada na parte superior esquerda do quadrado, então essa planta recebe o nome de b6 no canto superior esquerdo. Coloque o prato com fundo de vidro sob luz branca por um a dois dias antes de ser submetido a imagens de lapso de tempo todos os dias, por até três dias. Para reconstruir as imagens 3D, abra o arquivo ND2 e clique em volume.
Reconstrua a parede celular no dia zero, no primeiro dia, no terceiro dia e no quarto dia. Depois de tirar cada imagem, coloque o prato à base de vidro de volta na câmara de cultivo. Mudanças dinâmicas nas paredes transversais foram demonstradas pela coloração branco-calcofluor no tipo selvagem e mutantes ggb.
Para os mutantes ggb, as linhas tracejadas brancas abaixo de cada imagem indicam a parede celular da superfície quebrada nas células em expansão e as linhas laranjas indicam as células abaixo da superfície da parede celular em ggb. As diferenças no sinal calcofluor-branco podem ser detectadas nas posições superficiais das células e regiões menos densamente coradas indicaram expansão celular em mutantes ggb ou locais recém-ramificados no tipo selvagem. Para a pré-cultura do tipo selvagem, as plantas em luz vermelha fraca do acima por cinco dias são necessárias para induzir as respostas fototrópicas dos protonatos, de modo que as plantas possam ser anexadas ao fundo dos pratos e as plantas possam emergir dentro da distância objetiva de trabalho durante a imagem, porque o calcofluor-branco pode ser usado com outro corante, como a microesfera.
Informações adicionais sobre a expansão celular também podem ser estudadas. A dinâmica da parede celular da planta é fundamental para o crescimento e desenvolvimento eficiente, bem como para a resposta ao sinal ambiental. Este protocolo permite a divisão direta de alterações nos sinais da parede celular e na integração.
