Zeitrafferaufnahmen mit Fluoreszenzmikroskopie ermöglichen die Beobachtung der dynamischen Veränderungen von Wachstum und Entwicklung auf zellulärer und subzellulärer Ebene. Dieses einfache Protokoll für die 3D-Zeitraffer-Bildgebung kann die Zellwanddynamik über einen langen Zeitraum direkt untersuchen. Dieses Protokoll verwendet Calcofluorfarbstoff, um die Dynamik der Zellwanddicke zu markieren, und erfordert daher keine Transformation eines fluoreszierenden Proteins.
Die Calcofluor-Signale sind stabil und können länger als eine Woche anhalten. Diese Methode kann auf viele andere Systeme mit einfachen Strukturen, die Zellwände enthalten, angewendet werden und kann durch Calcofluor gefärbt werden, z. B. in Blütenpflanzen. In diesem Protokoll sind die Calcofluor-Signale stabil, wenn dieser Farbstoff während des gesamten Prozesses der Zeitraffer-Bildgebung innerhalb des Mediums gemischt wird.
Verteilen Sie zunächst das sieben Tage alte Moosgewebe in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen mit 20 Mikrolitern sterilisiertem Wasser. Für den Wildtyp verwenden Sie eine Pinzette, um die Protonemata zu trennen. Für die ggb-Mutante trennen Sie die Protonemata mit der AP-1000-Pipette.
Geben Sie 10 Mikroliter des sterilisierten Calcofluor-Weiß in das Mikroröhrchen und lassen Sie das Röhrchen zum Färben zwei Minuten aufrecht in der Haube. Unmittelbar nach dem Färben mischen Sie die Pflanzen mit 200 Mikrolitern gekühltem BCDATG-haltigen BCDATG-Medium, indem Sie fünfmal mit einer P1000-Pipette pipettieren und die Mischung in eine 27-Millimeter-Glasbodenschale überführen. Stellen Sie sicher, dass die 200 Mikroliter BCDATG mit den Proben gleichmäßig auf der Oberfläche der 27-Millimeter-Glasbodenschale verteilt sind, um eine dünne Schicht Film zu erzeugen, so dass sich die Proben während der Bildgebung innerhalb des objektiven Arbeitsabstands befinden.
Nach dem Erstarren für zwei Minuten bei Raumtemperatur die dünne Schicht mit drei Millilitern abgekühltem BCDATG abdecken und 10 Minuten ruhen lassen, um wieder zu erstarren. Zeichnen Sie auf der Unterseite der Schale jeweils neun Linien in paralleler und senkrechter Richtung und markieren Sie die Zeilen mit Zeichen von A bis H und die Spalten mit Zahlen von eins bis acht. Verwenden Sie oben, unten, rechts, in der Mitte und links, um die Positionen innerhalb jedes Quadrats zu markieren.
Wenn sich beispielsweise eine Pflanze in einem Quadrat in der zweiten Reihe, in der sechsten Spalte, befindet und im oberen linken Teil des Quadrats positioniert ist, erhält diese Pflanze den Namen b6 oben links. Stellen Sie die Glasbodenschale für ein bis zwei Tage unter weißes Licht, bevor Sie jeden Tag bis zu drei Tage lang einer Zeitrafferaufnahme unterzogen werden. Um die 3D-Bilder zu rekonstruieren, öffnen Sie die ND2-Datei und klicken Sie auf Lautstärke.
Rekonstruieren Sie die Zellwand am Tag Null, Tag eins, Tag drei und Tag vier. Nachdem Sie jedes Bild aufgenommen haben, legen Sie die Glasschale zurück in die Zuchtkammer. Dynamische Veränderungen der Querwände wurden durch Kalcofluor-Weiß-Färbung bei Wildtyp- und GGB-Mutanten gezeigt.
Bei ggb-Mutanten zeigen weiße gestrichelte Linien unter jedem Bild die gebrochene Oberflächenzellwand in den expandierenden Zellen und orangefarbene Linien die Zellen unter der Zellwandoberfläche in ggb an. Die Unterschiede im Calcofluor-Weiß-Signal können an den Oberflächenpositionen der Zellen nachgewiesen werden, und weniger dicht gefärbte Regionen deuteten auf eine Zellexpansion in ggb-Mutanten oder neu verzweigten Stellen im Wildtyp hin. Für die Wildtyp-Vorkultur sind die Pflanzen in schwachem rotem Licht von oben für fünf Tage erforderlich, um die phototropen Reaktionen von Protonemata zu induzieren, so dass die Pflanzen am Boden des Geschirrs befestigt werden können und die Pflanzen innerhalb des objektiven Aufwärtsabstandes während der Bildgebung auftauchen können, da Calcofluor-Weiß mit anderen Farbstoffen wie Mikrosphäre verwendet werden kann.
Zusätzliche Informationen über die Zellexpansion können ebenfalls untersucht werden. Die Dynamik der pflanzlichen Zellwand ist entscheidend für effizientes Wachstum und Entwicklung sowie für die Reaktion auf Umweltsignale. Dieses Protokoll ermöglicht die direkte Aufteilung von Änderungen in Zellwandsignalen und die Integration.
