Покадровая визуализация с флуоресцентной микроскопией позволяет наблюдать динамические изменения роста и развития на клеточном и субклеточном уровнях. Этот простой протокол для 3D-покадровой визуализации может напрямую изучать динамику клеточной стенки в течение длительного периода. Этот протокол использует калькофторовый краситель для обозначения динамики толщины клеточной стенки, и поэтому не требует преобразования флуоресцентного белка.
Сигналы калькофтора стабильны и могут длиться более недели. Этот метод может быть применен ко многим другим системам с простыми структурами, содержащими клеточные стенки, и может быть окрашен калькофтором, например, в цветущих растениях. В этом протоколе сигналы калькофтора стабильны, когда этот краситель смешивается в среде в течение всего процесса покадровой визуализации.
Для начала рассейте семидневную моховую ткань в микропробирке объемом 1,5 миллилитра, содержащей 20 микролитров стерилизованной воды. Для дикого типа используют щипцы для отделения протонемата. Для мутанта ggb отделите протонемат с помощью пипетки AP-1000.
Добавьте 10 микролитров стерилизованного калькофтор-белого цвета в микропробирку и оставьте трубку вертикально в вытяжке на две минуты для окрашивания. Сразу после окрашивания смешайте растения с 200 микролитрами охлажденной среды BCDATG, содержащей BCDAT, путем пипетки P1000 пять раз и переложите смесь в 27-миллиметровую стеклянную базовую посуду. Убедитесь, что 200 микролитров BCDATG с образцами равномерно распределены по поверхности 27-миллиметровой стеклянной нижней тарелки для получения тонкого слоя пленки, чтобы образцы находились в пределах объективного рабочего расстояния во время визуализации.
После затвердевания в течение двух минут при комнатной температуре накройте тонкий слой тремя миллилитрами охлажденного BCDATG и дайте ему схватиться в течение 10 минут, чтобы снова затвердеть. В нижней части тарелки нарисуйте по девять линий в параллельном и перпендикулярном направлениях и отметьте строки символами от A до H, а столбцы с цифрами от одного до восьми. Используйте верхнюю, нижнюю, правую, среднюю и левую стороны, чтобы отметить позиции в пределах каждого квадрата.
Например, если растение находится в квадрате во втором ряду, в шестом столбце и расположено в верхней левой части квадрата, то этому растению присваивается название b6 вверху слева. Поместите стеклянную нижнюю посуду под белый свет на один-два дня, прежде чем подвергаться покадровой визуализации каждый день, на срок до трех дней. Чтобы восстановить 3D-изображения, откройте файл ND2 и нажмите «Громкость».
Реконструируйте клеточную стенку в нулевой день, день первый, день третий и день четвертый. После взятия каждого изображения поместите стеклянную посуду обратно в камеру выращивания. Динамические изменения поперечных стенок были показаны калькофтор-белым окрашиванием в дикий тип и мутантами ggb.
Для мутантов ggb белые пунктирные линии под каждым изображением указывают на поврежденную поверхностную клеточную стенку в расширяющихся клетках, а оранжевые линии указывают на клетки под поверхностью клеточной стенки в ggb. Различия в кальцифтор-белом сигнале могут быть обнаружены на поверхностных позициях клеток и менее плотно окрашенных областях, указывающих на расширение клеток у мутантов ggb или новых ветвящихся участков в диком типе. Для дикорастущего типа предварительной культуры растения в слабом красном свете от вышеуказанного в течение пяти дней должны индуцировать фототропные реакции протонемата, чтобы растения могли быть прикреплены к нижней части посуды, и растения могли появляться в пределах объективного расстояния подъема во время визуализации, потому что калькофтор-белый может быть использован с другим красителем, таким как микросфера.
Также может быть изучена дополнительная информация о расширении клеток. Динамика клеточной стенки растений имеет решающее значение для эффективного роста и развития, а также для реагирования на сигнал окружающей среды. Этот протокол позволяет непосредственно разделять изменения сигналов клеточной стенки и интегрироваться.
