コケ物理層におけるカルコフルーアを用いた細胞壁動態の3次元タイムラプスイメージング

蛍光顕微鏡によるタイムラプスイメージングにより、細胞および細胞内レベルでの成長と発達の動的な変化を観察できます。3Dタイムラプスイメージング用のこのシンプルなプロトコルは、長期間にわたる細胞壁のダイナミクスを直接研究することができます。このプロトコルは、カルコフルオール色素を使用して細胞壁の厚さのダイナミクスをマークするため、蛍光タンパク質の形質転換を必要としません。

カルコフルーア信号は安定しており、1週間以上続くことがあります。この方法は、細胞壁を含む単純な構造を持つ他の多くのシステムに適用でき、顕花植物などのカルコフルアーで染色することができます。このプロトコルでは、タイムラプスイメージングの全プロセス中にこの色素を培地内で混合すると、カルコフルーア信号は安定しています。

まず、生後7日目のコケ組織を20マイクロリットルの滅菌水を入れた1.5ミリリットルのマイクロチューブに分散させます。野生型の場合は、鉗子を使用してプロトンマタを分離します。ggb変異体については、AP-1000ピペットを使用してプロトンマタを分離します。

滅菌したカルコフルオールホワイトを10マイクロリットルマイクロチューブに加え、染色のためにチューブをフードに2分間直立させたままにします。染色直後に、P1000ピペットで5回ピペッティングすることにより、植物を200マイクロリットルの冷却BCDATG含有BCDAT培地と混合し、混合物を27ミリメートルのガラスベースディッシュに移します。サンプルを含む200マイクロリットルのBCDATGが27ミリメートルのガラス底皿の表面に均一に分布し、イメージング中にサンプルが対物レンズの作動距離内にあるようにフィルムの薄層を生成することを確認します。

室温で2分間固化させた後、薄層を3ミリリットルの冷却BCDATGで覆い、10分間セットして再び固化させます。皿の底に平行方向と垂直方向にそれぞれ9本の線を引き、AからHまでの文字で行をマークし、1から8までの数字で列をマークします。上、下、右、中央、左を使用して、各正方形内の位置をマークします。

たとえば、植物が2行目の6列目の正方形にあり、正方形の左上部分に配置されている場合、この植物には左上のb6の名前が付けられます。ガラス底皿を白色光の下に1〜2日間置いてから、毎日最大3日間タイムラプスイメージングを行います。3D画像を再構築するには、ND2ファイルを開き、ボリュームをクリックします。

0日目、1日目、3日目、4日目に細胞壁を再構築します。各画像を撮影した後、ガラスベースの皿を成長チャンバーに戻します。クロスウォールの動的変化は、野生型およびggb変異体におけるカルコフルーア白色染色によって示された。

ggb変異体の場合、各画像の下の白い破線は拡大細胞における破断面の細胞壁を示し、オレンジ色の線はggbにおける細胞壁表面の下の細胞を示す。カルコフルオール-ホワイトシグナルの違いは、野生型のggb変異体または新たに分岐部位における細胞増殖を示す細胞の表面位置および密度の低い染色領域で検出することができる。野生型の前培養の場合, カルコフルオールホワイトはマイクロスフェアなどの他の色素と一緒に使用できるため、植物を皿の底に付着させ、植物をイメージング中に客観的なアップワーキング距離内に出現させることができるように、上記からの弱い赤色光で5日間植物を誘導する必要があります.

細胞増殖に関する追加情報も研究することができる。植物細胞壁のダイナミクスは、効率的な成長と発達、および環境シグナルへの応答に不可欠です。このプロトコルは、細胞壁シグナルの変化の分割および積分を直接可能にする。