该协议的目的是生成内源性编辑的飞线。我们以荧光蛋白敲入为例，但它也可以应用于其他敲入、敲除以及突变生成。我们的方案是基于CRISPR同源重组的方法，因此对突变位点几乎没有限制。
此外，我们的方案大大减少了基因分型步骤所涉及的时间和精力。首先，打开苍蝇CRISPR网站，为果蝇设计sgRNA，并输入围绕所需敲入位置的大约100个碱基对序列。使用五个主要鸟嘌呤选项选择 CRISPR 靶标。
单击“查找 CRISPR 靶标”按钮以生成可能的 sgRNA 序列列表。然后单击每个序列的评估按钮，并选择两个脱靶为零的 sgRNA。由于天然蛋白质表达水平通常要低得多，因此请选择明亮且光稳定且适合实验设置的荧光标签。
接下来，设计一个接头，将表位标签连接到荧光标记物以进行生化分析。使用2至20个氨基酸的连接肽，包括甘氨酸和丝氨酸等氨基酸。为了设计果蝇的供体载体，组织连接肽和荧光标签的DNA序列，并确保两端的同源序列。
修改供体质粒内的任何PAM序列，以维持所得蛋白质氨基酸序列。接下来，根据标签位置定位起始密码子和终止密码子。对于内部标记，请确保荧光标记与靶基因的编码序列在框架中。
对于 N 末端标记，将荧光标签放在内源性起始密码子之后。对于 C 末端标记，将荧光标签放在自然终止密码子之前。确保只保留一个起始密码子，以避免潜在的翻译问题。
使用基于替代限制性内切酶的克隆方法将 sgRNA 序列插入质粒 U6 Bbs1-chiRNA 质粒中。创建sgRNA质粒后，按照制造商的说明在DH5-α大肠杆菌中转化质粒。使用 T3 或 T7 标准测序引物通过 Sanger 测序验证所得克隆。
要创建供体质粒，请使用具有所需序列的双链 DNA，并将其整合到质粒 Bluesript 2SK 阴性多克隆位点中。对供体质粒进行测序，以确保 sgRNA 或 PAM 序列被正确修饰，并且质粒中不存在 SNP。接下来，取注射有构建的gRNA和供体质粒的Cas9果蝇。
用二氧化碳麻醉苍蝇，并将雄性苍蝇和处女雌性分开。要建立苍蝇杂交，将每个 G 零雄性与至少两个 FM7L 处女雌性配对在单独的窄 CT 食品瓶中。将交叉的小瓶放入通风的培养箱中，保持在25摄氏度和60%湿度下，直到F1苍蝇关闭。
然后麻醉并从G zero雄性和雌性杂交中收集至少10个处女雌性后代。确保每只 F1 苍蝇都标有其亲本的详细信息并单独存储。为了筛选果蝇进行PCR，设计熔解温度约为55摄氏度的引物，包括靶基因的编辑位点。
为每个苍蝇样品准备裂解缓冲液，并将 10 μL 分配到 96 孔 PCR 板的每个孔中。在腿部解剖过程中将缓冲液保持在低温。接下来，准备玻璃毛细管，一端填充蔗糖琼脂食物。
将这些管子放在一个 96 孔深的孔板中，称为苍蝇旅馆。对于腿部夹层，将二氧化碳麻醉垫置于立体显微镜下。麻醉候选苍蝇，并切断它的一条中腿。
之后，将腿浸入裂解缓冲液中。用一把细金属镊子握住飞翼。将苍蝇移至苍蝇旅馆，并立即用纱线密封管子。
将苍蝇酒店安置在通风的培养箱中，保持在 25 摄氏度和 60% 湿度。将断腿浸没在热循环仪中的裂解缓冲溶液中。按照制造商的指示组织PCR反应，使用1.5微升蝇腿裂解物作为DNA源。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并根据条带大小解释结果。根据凝胶结果，从苍蝇旅馆中选择阳性果蝇，并将它们与平衡苍蝇单独杂交以产生 F2 代。使用纯合母液对编辑位点进行 Sanger 测序，以确保准确性。
与野生型苍蝇进行回交验证的飞线，以去除背景突变。使用单腿PCR方案筛选每一代。成年果蝇大脑的共聚焦显微镜图像显示，在整个深夜和清晨的时间点，周期蛋白被组织成谨慎的核病灶。
总体而言，如果您的基因分型PCR引物具有特异性，则该协议是稳健的。
