Bu protokolün amacı, endojen düzenlenmiş bir sinek hattı oluşturmaktır. Örnek olarak bir floresan protein knock-in'i gösteriyoruz, ancak diğer knock-in, knockout ve mutasyon oluşumuna da uygulanabilir. Protokolümüz CRISPR homolog rekombinasyon tabanlı bir yöntemdir, bu nedenle mutasyon bölgelerinde neredeyse hiçbir kısıtlama yoktur.
Ayrıca, protokolümüz genotipleme adımlarında harcanan zamanı ve çabayı büyük ölçüde azalttı. Başlamak için, Drosophila için sgRNA'lar tasarlamak üzere fly CRISPR web sitesini açın ve istenen knock-in konumunu çevreleyen yaklaşık 100 baz çifti dizisi girin. Beş ana guanin seçeneğiyle CRISPR hedeflerini seçin.
Olası sgRNA dizilerinin bir listesini oluşturmak için CRISPR hedeflerini bul düğmesine tıklayın. Ardından her dizi için değerlendir düğmesine tıklayın ve sıfır hedefi olan iki sgRNA seçin. Doğal protein ekspresyon seviyeleri tipik olarak çok daha düşük olduğundan, parlak ve fotostabil olan ve deney düzeneğine uyan floresan etiketleri seçin.
Ardından, epitop etiketlerini biyokimyasal analiz için floresan işaretleyiciye bağlamak için bir bağlayıcı tasarlayın. Glisin ve serin gibi amino asitleri içeren iki ila 20 amino asit arasında değişen bir bağlayıcı peptit kullanın. Drosophila için donör vektörünü tasarlamak için, bağlayıcı peptitin ve floresan etiketin DNA dizisini düzenleyin ve her iki ucu çevreleyen homolog diziler sağlayın.
Elde edilen protein amino asit dizisini korumak için donör plazmidi içindeki herhangi bir PAM dizisini değiştirin. Ardından, etiket konumuna bağlı olarak başlatma ve durdurma kodonlarını konumlandırın. Dahili etiketleme için, floresan etiketin hedef genin kodlama dizisiyle çerçevede olduğundan emin olun.
N-terminal etiketleme için, floresan etiketini endojen başlangıç kodonundan sonra konumlandırın. C-terminali etiketlemesi için, floresan etiketini doğal durdurma kodonunun önüne yerleştirin. Olası çeviri sorunlarını önlemek için yalnızca tek bir başlangıç kodonunu sakladığınızdan emin olun.
sgRNA dizisini plazmid U6 Bbs1-chiRNA plazmidine eklemek için alternatif restriksiyon enzimi tabanlı klonlama yaklaşımını kullanın. SgRNA plazmidini oluşturduktan sonra, plazmiti üreticinin talimatlarına göre DH5-Alfa Escherichia coli'ye dönüştürün. Elde edilen klonları, T3 veya T7 standart dizileme primerlerini kullanarak Sanger dizilimi yoluyla doğrulayın.
Donör plazmidini oluşturmak için, istenen diziye sahip çift sarmallı DNA kullanın ve onu plazmid Bluesript 2SK negatif çoklu klonlama bölgesine entegre edin. sgRNA veya PAM dizilerinin doğru şekilde değiştirildiğinden ve plazmidde SNP bulunmadığından emin olmak için donör plazmitini sıralayın. Ardından, yapılandırılmış gRNA ve donör plazmitleri ile enjekte edilen Cas9 sineklerini alın.
Sinekleri karbondioksit ile uyuşturun ve erkek sinekleri ve bakire dişileri ayırın. Sinek çaprazları oluşturmak için, her bir G sıfır erkeği ayrı dar CT gıda şişelerinde en az iki FM7L bakire dişi ile eşleştirin. Çapraz şişeleri, F1 yaklaşana kadar 25 santigrat derece ve% 60 nemde tutulan havalandırmalı bir inkübatöre yerleştirin.
Daha sonra anestezi uygulayın ve hem G sıfır erkek hem de dişi melezlerden en az 10 bakire dişi yavru toplayın. Her F1 sineğinin ebeveyninin ayrıntılarıyla etiketlendiğinden ve ayrı olarak saklandığından emin olun. Sinekleri PCR için taramak için, hedef genin düzenleme bölgesini kapsayan yaklaşık 55 santigrat derece erime sıcaklığına sahip primerler tasarlayın.
Her sinek numunesi için lizis tamponu hazırlayın ve 96 oyuklu bir PCR plakasının her bir oyuğuna 10 mikrolitre dağıtın. Bacak diseksiyon işlemi sırasında tamponu soğuk bir sıcaklıkta tutun. Daha sonra, bir ucunu sakaroz agar yemi ile doldurarak cam kılcal tüpler hazırlayın.
Bu tüpleri, sinek oteli olarak adlandırılan 96 kuyu derinliğinde bir kuyu plakasına yerleştirin. Bacak diseksiyonu için, karbondioksit anestezi pedini stereo mikroskop altında konumlandırın. Aday bir sineği uyuşturun ve orta bacaklarından birini kesin.
Bundan sonra, bacağı lizis tamponuna daldırın. Sinek kanadını bir çift ince metal forseps ile tutun. Sineği sinek oteline taşıyın ve tüpü hemen iplikle kapatın.
Sinek otelini 25 santigrat derece ve% 60 nemde tutulan havalandırmalı bir inkübatörde barındırın. Kopan bacakları bir termal döngüleyicide lizis tampon çözeltisine daldırın. DNA kaynağı olarak 1.5 mikrolitre sinek bacağı lizatı kullanarak PCR reaksiyonunu üretici tarafından talimat verildiği şekilde düzenleyin.
PCR ürünlerini agaroz jel elektroforezine tabi tutun ve sonuçları bant boyutuna göre yorumlayın. Jel sonuçlarına dayanarak, uçuş otelinden pozitif sinekleri seçin ve F2 neslini üretmek için bunları dengeleyici sineklerle ayrı ayrı çaprazlayın. Doğruluğu sağlamak için düzenleme sitesinin Sanger sıralaması için homozigot stokları kullanın.
Arka plan mutasyonlarını ortadan kaldırmak için vahşi tip sineklerle geri çapraz doğrulanmış sinek çizgileri. Tek bacaklı PCR protokolünü kullanarak her nesli tarayın. Yetişkin Drosophila beyinlerinin konfokal mikroskop görüntüleri, gece geç saatlerde ve sabahın erken saatlerinde gizli nükleer odaklar halinde organize edilmiş dönem proteini gösterdi.
Genel olarak, genotipleme PCR primerleriniz spesifikse bu protokol sağlamdır.
