Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, eine endogene editierte Fliegenschnur zu erzeugen. Wir zeigen ein fluoreszierendes Protein-Knock-in als Beispiel, aber es könnte auch auf andere Knock-in-, Knockout- sowie Mutationsgenerierung angewendet werden. Unser Protokoll ist eine CRISPR-homologe Rekombinationsmethode, so dass es fast keine Einschränkung der Mutationsstellen gibt.
Darüber hinaus reduzierte unser Protokoll den Zeit- und Arbeitsaufwand für Genotypisierungsschritte erheblich. Öffnen Sie zunächst die fly CRISPR-Website, um sgRNAs für Drosophila zu entwerfen, und geben Sie etwa 100 Basenpaarsequenzen ein, die die gewünschte Knock-in-Stelle umgeben. Wählen Sie CRISPR-Ziele mit der Fünf-Prime-Guanin-Option.
Klicken Sie auf die Schaltfläche CRISPR-Ziele suchen, um eine Liste möglicher sgRNA-Sequenzen zu erstellen. Klicken Sie dann für jede Sequenz auf die Schaltfläche "Bewerten" und wählen Sie zwei sgRNAs aus, die keine Off-Targets haben. Da die natürlichen Proteinexpressionsniveaus in der Regel viel niedriger sind, wählen Sie fluoreszierende Markierungen, die hell und photostabil sind und zum Versuchsaufbau passen.
Entwerfen Sie als Nächstes einen Linker, um Epitop-Tags für die biochemische Analyse mit dem Fluoreszenzmarker zu verknüpfen. Verwenden Sie ein Linkerpeptid mit zwei bis 20 Aminosäuren, das Aminosäuren wie Glycin und Serin enthält. Um den Donorvektor für Drosophila zu entwerfen, organisieren Sie die DNA-Sequenz des Linkerpeptids und der Fluoreszenzmarkierung und stellen Sie sicher, dass homologe Sequenzen beide Enden flankieren.
Modifizieren Sie alle PAM-Sequenzen innerhalb des Spenderplasmids, um die resultierende Proteinaminosäuresequenz beizubehalten. Positionieren Sie als Nächstes die Start- und Stopp-Codons je nach Position des Tags. Stellen Sie für die interne Markierung sicher, dass sich die Fluoreszenzmarkierung im Rahmen der kodierenden Sequenz des Zielgens befindet.
Positionieren Sie für die N-Terminus-Markierung die Fluoreszenzmarkierung nach dem endogenen Startcodon. Positionieren Sie für die C-Terminus-Kennzeichnung die fluoreszierende Markierung vor dem natürlichen Stoppcodon. Stellen Sie sicher, dass Sie nur ein einziges Startcodon beibehalten, um potenzielle Übersetzungsprobleme zu vermeiden.
Verwenden Sie den alternativen Restriktionsenzym-basierten Klonierungsansatz, um die sgRNA-Sequenz in das Plasmid U6 Bbs1-chiRNA-Plasmid einzufügen. Transformieren Sie das Plasmid nach der Erstellung des sgRNA-Plasmids gemäß den Anweisungen des Herstellers in DH5-Alpha-Escherichia coli. Überprüfen Sie die resultierenden Klone durch Sanger-Sequenzierung mit T3- oder T7-Standard-Sequenzierungsprimern.
Um das Spenderplasmid herzustellen, verwenden Sie doppelsträngige DNA mit der gewünschten Sequenz und integrieren Sie sie in die Plasmid-Bluesript 2SK-negative Mehrfachklonierungsstelle. Sequenzieren Sie das Spenderplasmid, um sicherzustellen, dass sgRNA- oder PAM-Sequenzen korrekt modifiziert sind und keine SNPs im Plasmid vorhanden sind. Nehmen Sie als Nächstes Cas9-Fliegen, denen die konstruierte gRNA und Spenderplasmide injiziert wurden.
Betäuben Sie die Fliegen mit Kohlendioxid und trennen Sie männliche Fliegen und jungfräuliche Weibchen. Um Fliegenkreuzungen zu etablieren, paaren Sie jedes G-Null-Männchen mit mindestens zwei jungfräulichen FM7L-Weibchen in einzelnen schmalen CT-Lebensmittelfläschchen. Stellen Sie die gekreuzten Fläschchen in einen belüfteten Inkubator, der bei 25 Grad Celsius und 60 % Luftfeuchtigkeit gehalten wird, bis sich die F1-Fliegen schließen.
Dann betäuben und sammeln Sie mindestens 10 jungfräuliche weibliche Nachkommen aus männlichen und weiblichen G-Null-Kreuzungen. Stellen Sie sicher, dass jede F1-Fliege mit den Details ihrer Abstammung gekennzeichnet und separat aufbewahrt wird. Um Fliegen für die PCR zu screenen, entwerfen Sie Primer mit einer Schmelztemperatur von etwa 55 Grad Celsius, die die Bearbeitungsstelle des Zielgens umfassen.
Bereiten Sie einen Lysepuffer für jede Fliegenprobe vor und geben Sie 10 Mikroliter in jede Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte. Halten Sie den Puffer während des Beindissektionsprozesses auf einer kalten Temperatur. Bereiten Sie als nächstes Glaskapillarröhrchen vor und füllen Sie ein Ende mit Saccharose-Agar-Nahrung.
Legen Sie diese Röhrchen in eine 96-Well-Deep-Well-Platte, die als Fly-Hotel bezeichnet wird. Positionieren Sie für die Beindissektion das Kohlendioxid-Anästhesiekissen unter einem Stereomikroskop. Betäuben Sie eine Kandidatenfliege und trennen Sie eines ihrer Mittelbeine ab.
Tauchen Sie danach das Bein in den Lysepuffer. Halten Sie den Flügel mit einer feinen Metallzange fest. Bringen Sie die Fliege zum Fliegenhotel und verschließen Sie den Schlauch sofort mit Garn.
Beherbergen Sie das Fliegenhotel in einem belüfteten Inkubator, der bei 25 Grad Celsius und 60 % Luftfeuchtigkeit gehalten wird. Tauchen Sie die abgetrennten Beine in die Lysepufferlösung in einem Thermocycler. Organisieren Sie die PCR-Reaktion gemäß den Anweisungen des Herstellers und verwenden Sie 1,5 Mikroliter des Fliegenschenkellysats als DNA-Quelle.
Die PCR-Produkte einer Agarose-Gelelektrophorese zu unterziehen und die Ergebnisse anhand der Bandengröße zu interpretieren. Wählen Sie anhand der Gelergebnisse die positiven Fliegen aus dem Fliegenhotel aus und kreuzen Sie sie einzeln mit Balancerfliegen, um die F2-Generation zu erzeugen. Verwenden Sie homozygote Bestände für die Sanger-Sequenzierung der Bearbeitungsstelle, um die Genauigkeit zu gewährleisten.
Rückkreuzung validierter Fliegenlinien mit Wildtyp-Fliegen, um Hintergrundmutationen zu entfernen. Screenen Sie jede Generation mit dem einbeinigen PCR-Protokoll. Konfokale Mikroskopbilder von erwachsenen Drosophila-Gehirnen zeigten Periodenproteine, die während der späten Nacht und des frühen Morgens in diskreten Kernherden organisiert waren.
Insgesamt ist dieses Protokoll robust, wenn Ihre Genotypisierungs-PCR-Primer spezifisch sind.
