O objetivo deste protocolo é gerar uma linha de mosca editada endógena. Mostramos uma proteína fluorescente knock-in como exemplo, mas ela também pode ser aplicada a outros knock-in, knockout, bem como geração de mutação. Nosso protocolo é um método baseado em recombinação homóloga CRISPR, portanto, quase não há restrição nos locais de mutação.
Além disso, nosso protocolo reduziu muito o tempo e o esforço envolvidos nas etapas de genotipagem. Para começar, abra o site CRISPR da fly para projetar sgRNAs para Drosophila e insira aproximadamente 100 sequências de pares de base em torno do local desejado. Selecione alvos CRISPR com a opção de guanina cinco prime.
Clique no botão localizar alvos CRISPR para gerar uma lista de possíveis sequências de sgRNA. Em seguida, clique no botão avaliar para cada sequência e escolha dois sgRNAs que tenham zero off-targets. Como os níveis de expressão de proteína natural são tipicamente muito mais baixos, selecione etiquetas fluorescentes que sejam brilhantes e fotoestáveis e se encaixe na configuração experimental.
Em seguida, projete um linker para vincular etiquetas de epítopos ao marcador fluorescente para análise bioquímica. Use um peptídeo ligante que varia de dois a 20 aminoácidos, compreendendo aminoácidos como glicina e serina. Para projetar o vetor doador para Drosophila, organize a sequência de DNA do peptídeo ligante e da etiqueta fluorescente, e garanta sequências homólogas flanqueando ambas as extremidades.
Modificar quaisquer sequências PAM dentro do plasmídeo doador para manter a sequência de aminoácidos de proteínas resultantes. Em seguida, posicione os códons de início e parada dependendo do local da tag. Para marcação interna, certifique-se de que a etiqueta fluorescente esteja no quadro com a sequência codificadora do gene alvo.
Para a marcação N-terminal, posicione o tag fluorescente após o códon de início endógeno. Para a marcação C-terminus, posicione a etiqueta fluorescente antes do códon de parada natural. Certifique-se de manter apenas um único códon inicial para evitar possíveis problemas de tradução.
Use a abordagem alternativa de clonagem baseada em enzimas de restrição para inserir a sequência de sgRNA no plasmídeo U6 Bbs1-chiRNA. Depois de criar o plasmídeo de sgRNA, transforme o plasmídeo em DH5-Alpha Escherichia coli de acordo com as instruções do fabricante. Verifique os clones resultantes por meio do sequenciamento de Sanger, usando primers de sequenciamento padrão T3 ou T7.
Para criar o plasmídeo doador, use DNA de fita dupla com a sequência desejada e integre-o ao sítio de clonagem múltipla do plasmídeo Bluesript 2SK negativo. Sequenciar o plasmídeo doador para garantir que as sequências de sgRNA ou PAM sejam modificadas corretamente e não haja SNPs presentes no plasmídeo. Em seguida, tome moscas Cas9 injetadas com o gRNA construído e plasmídeos doadores.
Anestesiar as moscas com dióxido de carbono e separar moscas machos e fêmeas virgens. Para estabelecer cruzamentos de moscas, emparelhe cada macho G zero com pelo menos duas fêmeas virgens FM7L em frascos de alimento CT estreitos individuais. Coloque frascos cruzados em uma incubadora ventilada mantida a 25 graus Celsius e 60% de umidade até que as moscas F1 se fechem.
Em seguida, anestesiar e coletar pelo menos 10 filhotes fêmeas virgens de ambos os cruzamentos G zero macho e fêmea. Certifique-se de que cada mosca de F1 seja marcada com os detalhes de sua filiação e armazenada separadamente. Para rastrear moscas para PCR, projete primers com uma temperatura de fusão de cerca de 55 graus Celsius que abrangem o local de edição do gene alvo.
Prepare o tampão de lise para cada amostra de mosca e distribua 10 microlitros em cada poço de uma placa de PCR de 96 poços. Mantenha o tampão a uma temperatura fria durante o processo de dissecção da perna. Em seguida, prepare tubos capilares de vidro, enchendo uma extremidade com alimento de ágar sacarose.
Coloque esses tubos em uma placa de poço profundo de 96 poços, conhecida como o hotel da mosca. Para a dissecção da perna, posicione a almofada de anestesia de dióxido de carbono sob um microscópio estéreo. Anestesiar uma mosca candidata e cortar uma de suas pernas do meio.
Depois disso, mergulhe a perna no tampão de lise. Segure a asa de mosca com um par de pinças finas de metal. Mova a mosca para o fly hotel e sele o tubo com fios imediatamente.
Hospede o hotel de moscas em uma incubadora ventilada mantida a 25 graus Celsius e 60% de umidade. Submergir as pernas decepadas na solução tampão de lise em um termociclador. Organizar a reação de PCR conforme as instruções do fabricante, usando 1,5 microlitros de lisado da perna de mosca como fonte de DNA.
Submeter os produtos de PCR à eletroforese em gel de agarose e interpretar os resultados com base no tamanho da banda. Com base nos resultados do gel, selecione as moscas positivas do hotel de moscas e cruze-as individualmente com moscas balanceadoras para produzir a geração F2. Use estoques homozigotos para o sequenciamento Sanger do site de edição para garantir a precisão.
Retrocruzamento de linhas de moscas validadas com moscas selvagens para remover mutações de fundo. Rastreie cada geração usando o protocolo de PCR de perna única. Imagens de microscópio confocal de cérebros adultos de Drosophila mostraram proteínas menstruais organizadas em focos nucleares discretos ao longo da noite e início da manhã.
No geral, esse protocolo é robusto se os primers de PCR de genotipagem forem específicos.
