このプロトコルの目的は、内因性編集されたフライラインを生成することです。ここでは蛍光タンパク質のノックインを例に挙げていますが、他のノックイン、ノックアウト、突然変異の生成にも応用できます。私たちのプロトコルはCRISPR相同組換えベースの方法であるため、変異部位に制限はほとんどありません。
さらに、当社のプロトコルは、ジェノタイピングステップにかかる時間と労力を大幅に削減しました。まず、ショウジョウバエのsgRNAをデザインするためのfly CRISPRのウェブサイトを開き、目的のノックイン位置を囲む約100塩基対の配列を入力します。5プライムグアニンオプションでCRISPRターゲットを選択します。
[CRISPRターゲットの検索]ボタンをクリックして、可能なsgRNA配列のリストを生成します。次に、各配列の評価ボタンをクリックし、オフターゲットがゼロの 2 つの sgRNA を選択します。天然のタンパク質発現レベルは通常はるかに低いため、明るく光安定性があり、実験セットアップに適合する蛍光タグを選択してください。
次に、生化学分析のためにエピトープタグを蛍光マーカーにリンクするリンカーを設計します。グリシンやセリンなどのアミノ酸を含む2〜20アミノ酸のリンカーペプチドを使用します。ショウジョウバエのドナーベクターを設計するには、リンカーペプチドと蛍光タグのDNA配列を整理し、両末端に隣接する相同配列を確保します。
ドナープラスミド内のPAM配列を修飾して、得られたタンパク質のアミノ酸配列を維持します。次に、タグの位置に応じて開始コドンとストップコドンを配置します。内部タグ付けの場合は、蛍光タグが標的遺伝子のコード配列とフレーム内にあることを確認してください。
N末端タグ付けでは、内因性開始コドンの後に蛍光タグを配置します。C末端タグ付けでは、蛍光タグを自然終止コドンの前に配置します。潜在的な翻訳の問題を回避するために、開始コドンを1つだけ保持するようにしてください。
代替の制限酵素ベースのクローニングアプローチを使用して、sgRNA配列をプラスミドU6 Bbs1-chiRNAプラスミドに挿入します。sgRNAプラスミドを作成した後、メーカーの指示に従ってDH5-Alpha大腸菌でプラスミドを形質転換します。得られたクローンを、T3またはT7標準シーケンシングプライマーを用いて、サンガーシーケンシングで検証します。
ドナープラスミドを作製するには、目的の配列を持つ二本鎖DNAを使用し、それをプラスミドBluesript 2SKネガティブマルチクローニングサイトに組み込みます。ドナープラスミドをシーケンシングして、sgRNAまたはPAM配列が正しく修飾され、プラスミドにSNPが存在しないことを確認します。次に、構築したgRNAとドナープラスミドを注入したCas9ハエを採取します。
ハエに二酸化炭素を麻酔し、オスのハエと処女のメスを分離します。ハエの交配を確立するには、個々の狭いCTフードバイアルで、各Gゼロオスと少なくとも2匹のFM7Lバージンメスをペアにします。交差したバイアルを、摂氏25度、湿度60%に維持された通気孔付きインキュベーターに、F1が閉じるまで置きます。
次に、麻酔をかけ、G zeroの男性と女性の両方の交配から少なくとも10匹の処女の女性の子孫を収集します。各F1フライに親子関係の詳細がタグ付けされ、別々に保存されていることを確認してください。PCR用のハエをスクリーニングするには、標的遺伝子の編集部位を囲む融解温度が摂氏約55度になるプライマーを設計します。
各ハエサンプルの溶解バッファーを調製し、96ウェルPCRプレートの各ウェルに10マイクロリットルを分注します。脚の解剖プロセス中は、バッファーを低温に維持します。次に、ガラスキャピラリーチューブを準備し、一端にスクロース寒天食品を充填します。
これらのチューブを、フライホテルと呼ばれる96ウェルの深さのウェルプレートに入れます。脚の解剖の場合は、二酸化炭素麻酔パッドを実体顕微鏡の下に置きます。候補のハエに麻酔をかけ、その真ん中の脚の1つを切断します。
その後、脚を溶解緩衝液に浸します。一対の細かい金属製の鉗子でフライグライダーを持ちます。フライをフライホテルに移動し、すぐにチューブを糸で密封します。
ハエのホテルは、摂氏25度、湿度60%に保たれた通気孔付きインキュベーターに入れます。切断した脚をサーマルサイクラーの溶解緩衝液に浸します。メーカーの指示に従って、1.5マイクロリットルのフライレッグライセートをDNAソースとして使用してPCR反応を整理します。
PCR産物をアガロースゲル電気泳動にかけ、バンドサイズに基づいて結果を解釈します。ゲルの結果に基づいて、フライホテルからポジティブフライを選択し、バランサーフライと個別に交配してF2世代を生成します。編集部位のサンガーシーケンシングにはホモ接合体ストックを使用し、正確性を確保します。
検証済みのフライラインと野生型ハエを戻し交配し、バックグラウンド変異を除去します。シングルレッグPCRプロトコルを使用して各世代をスクリーニングします。ショウジョウバエの成虫の脳の共焦点顕微鏡画像は、深夜から早朝にかけて、目立たない核病巣に組織化された期間タンパク質を示しました。
全体として、このプロトコルは、ジェノタイピングPCRプライマーが特異的である場合に頑健です。
