El propósito de este protocolo es generar una línea de mosca editada endógena. Mostramos como ejemplo un knock-in de proteína fluorescente, pero también podría aplicarse a otros knock-in, knock-out, así como a la generación de mutaciones. Nuestro protocolo es un método basado en la recombinación homóloga de CRISPR, por lo que casi no hay restricciones en los sitios de mutación.
Además, nuestro protocolo redujo en gran medida el tiempo y el esfuerzo involucrados en los pasos de genotipado. Para empezar, abra el sitio web de fly CRISPR para diseñar sgRNAs para Drosophila, e introduzca aproximadamente 100 secuencias de pares de bases que rodeen la ubicación deseada del knock-in. Seleccione objetivos CRISPR con la opción de guanina de cinco primos.
Haga clic en el botón Buscar objetivos CRISPR para generar una lista de posibles secuencias de sgRNA. A continuación, haga clic en el botón de evaluación de cada secuencia y elija dos sgRNAs que tengan cero objetivos externos. Dado que los niveles de expresión natural de proteínas suelen ser mucho más bajos, seleccione etiquetas fluorescentes que sean brillantes y fotoestables, y que se ajusten a la configuración experimental.
A continuación, diseñe un enlazador para vincular las etiquetas de epítopos al marcador fluorescente para el análisis bioquímico. Utilice un péptido enlazador que oscile entre dos y 20 aminoácidos, que comprenda aminoácidos como la glicina y la serina. Para diseñar el vector donante de Drosophila, organice la secuencia de ADN del péptido enlazador y la etiqueta fluorescente, y asegure secuencias homólogas que flanqueen ambos extremos.
Modifique cualquier secuencia de PAM dentro del plásmido donante para mantener la secuencia de aminoácidos de las proteínas resultante. A continuación, coloque los codones de inicio y parada en función de la ubicación de la etiqueta. Para el marcaje interno, asegúrese de que la etiqueta fluorescente esté en el marco con la secuencia codificante del gen diana.
Para el marcaje N-terminal, coloque la etiqueta fluorescente después del codón de inicio endógeno. Para el marcado C-terminal, coloque la etiqueta fluorescente antes del codón de parada natural. Asegúrese de conservar un solo codón de inicio para evitar posibles problemas de traducción.
Utilice el enfoque alternativo de clonación basado en enzimas de restricción para insertar la secuencia de sgRNA en el plásmido U6 Bbs1-chiRNA. Después de crear el plásmido sgRNA, transforme el plásmido en DH5-Alpha Escherichia coli según las instrucciones del fabricante. Verifique los clones resultantes a través de la secuenciación Sanger, utilizando cebadores de secuenciación estándar T3 o T7.
Para crear el plásmido donante, utilice ADN bicatenario con la secuencia deseada e intégrelo en el sitio de clonación múltiple negativo del plásmido Bluesript 2SK. Secuenciar el plásmido donante para asegurarse de que las secuencias de sgRNA o PAM se modifiquen correctamente y que no haya SNP presentes en el plásmido. A continuación, tome moscas Cas9 inyectadas con el ARNg construido y plásmidos donantes.
Anestesiar las moscas con dióxido de carbono y separar las moscas macho de las hembras vírgenes. Para establecer cruces de moscas, empareje cada macho G zero con al menos dos hembras vírgenes FM7L en viales individuales estrechos de alimento CT. Coloque los viales cruzados en una incubadora ventilada mantenida a 25 grados centígrados y 60% de humedad hasta que las moscas F1 se cierren.
A continuación, anestesia y recoge al menos 10 crías femeninas vírgenes de cruces de machos y hembras G zero. Asegúrese de que cada mosca F1 esté etiquetada con los detalles de su parentesco y almacenada por separado. Para detectar la PCR en las moscas, diseñe cebadores con una temperatura de fusión de alrededor de 55 grados centígrados que abarquen el sitio de edición del gen diana.
Prepare un tampón de lisis para cada muestra de mosca y dispense 10 microlitros en cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos. Mantenga el tampón a una temperatura fría durante el proceso de disección de la pierna. A continuación, prepare tubos capilares de vidrio, llenando un extremo con comida de agar sacarosa.
Coloque estos tubos en una placa de pocillos de 96 pocillos de profundidad, conocida como el hotel de moscas. Para la disección de las piernas, coloque la almohadilla de anestesia de dióxido de carbono bajo un microscopio estereoscópico. Anestesiar una mosca candidata y cortarle una de sus patas medias.
Después de eso, sumerja la pierna en el tampón de lisis. Sostén el ala de la mosca con un par de pinzas de metal fino. Mueva la mosca al hotel de mosca y selle el tubo con hilo inmediatamente.
Aloje el hotel de moscas en una incubadora ventilada mantenida a 25 grados centígrados y 60% de humedad. Sumerja las patas cortadas en la solución tampón de lisis en un termociclador. Organice la reacción de PCR según las instrucciones del fabricante, utilizando 1,5 microlitros del lisado de patas de mosca como fuente de ADN.
Someter los productos de PCR a electroforesis en gel de agarosa e interpretar los resultados en función del tamaño de la banda. En función de los resultados del gel, seleccione las moscas positivas del hotel de moscas y crúcelas individualmente con moscas de equilibrio para producir la generación F2. Utilice material homocigótico para la secuenciación Sanger del sitio de edición para garantizar la precisión.
Cruza las líneas de mosca validadas con moscas de tipo salvaje para eliminar las mutaciones de fondo. Realice pruebas de detección en cada generación mediante el protocolo de PCR de una sola pierna. Las imágenes de microscopio confocal de cerebros adultos de Drosophila mostraron proteínas del período organizadas en focos nucleares discretos a lo largo de la noche y las primeras horas de la mañana.
En general, este protocolo es sólido si sus cebadores de PCR de genotipado son específicos.
