이 프로토콜의 목적은 내인성 편집 플라이 라인을 생성하는 것입니다. 형광 단백질 knock-in을 예로 들었지만, 다른 knock-in, knockout 및 돌연변이 생성에도 적용할 수 있습니다. 당사의 프로토콜은 CRISPR 상동 재조합 기반 방법이므로 돌연변이 부위에 대한 제한이 거의 없습니다.
또한, 당사의 프로토콜은 유전형 분석 단계와 관련된 시간과 노력을 크게 줄였습니다. 먼저 fly CRISPR 웹사이트를 열어 Drosophila용 sgRNA를 설계하고 원하는 knock-in 위치를 둘러싼 약 100개의 염기쌍 염기서열을 입력합니다. 5가지 프라임 구아닌 옵션으로 CRISPR 표적을 선택합니다.
CRISPR 타겟 찾기 버튼을 클릭하여 가능한 sgRNA 염기서열 목록을 생성합니다. 그런 다음 각 염기서열에 대한 평가 버튼을 클릭하고 off-target이 0인 두 개의 sgRNA를 선택합니다. 천연 단백질 발현 수준은 일반적으로 훨씬 낮기 때문에 밝고 광안정성이 있으며 실험 설정에 맞는 형광 태그를 선택하십시오.
다음으로, 생화학 분석을 위해 epitope tag를 형광 마커에 연결하는 링커를 설계합니다. 글리신과 세린과 같은 아미노산으로 구성된 2개에서 20개의 아미노산 범위의 링커 펩타이드를 사용하십시오. 초파리(Drosophila)의 donor 벡터를 설계하려면 링커 펩타이드와 형광 태그의 DNA 염기서열을 구성하고 양쪽 말단 측면에 상동 염기서열을 보장합니다.
donor plasmid 내의 PAM 염기서열을 수정하여 생성된 단백질 아미노산 염기서열을 유지합니다. 다음으로, 태그 위치에 따라 시작 및 중지 코돈의 위치를 지정합니다. 내부 태깅의 경우 형광 태그가 표적 유전자의 코딩 서열과 함께 프레임에 있는지 확인합니다.
N-말단 태깅의 경우, 내인성 시작 코돈 뒤에 형광 태크를 배치합니다. C-말단 태깅의 경우, 형광 태깅을 자연 정지 코돈 앞에 놓습니다. 잠재적인 번역 문제를 피하기 위해 단일 시작 코돈만 유지해야 합니다.
선택적 제한 효소 기반 클로닝 접근법을 사용하여 sgRNA 염기서열을 플라스미드 U6 Bbs1-chiRNA 플라스미드에 삽입합니다. sgRNA 플라스미드를 생성한 후 제조업체의 지침에 따라 DH5-Alpha Escherichia coli의 플라스미드를 형질전환시킵니다. T3 또는 T7 표준 염기서열분석 프라이머를 사용하여 Sanger 염기서열분석을 통해 결과 클론을 검증합니다.
donor plasmid를 생성하려면 원하는 염기서열을 가진 double-stranded DNA를 사용하여 plasmid Bluesript 2SK negative multiple cloning site에 통합합니다. donor plasmid의 염기서열을 분석하여 sgRNA 또는 PAM 염기서열이 올바르게 수정되고 plasmid에 SNP가 존재하지 않도록 합니다. 다음으로, 구성된 gRNA와 donor plasmid를 주입한 Cas9 파리를 채취합니다.
파리를 이산화탄소로 마취시키고 수컷 파리와 처녀 암컷을 분리합니다. 플라이 크로스를 설정하려면 각 G zero 수컷을 개별 좁은 CT 식품 바이알에 최소 2개의 FM7L 처녀 암컷과 짝을 이룹니다. F1이 근접할 때까지 섭씨 25도, 습도 60%로 유지되는 통풍이 잘되는 인큐베이터에 교차된 바이알을 넣습니다.
그런 다음 G 0 남성과 여성 교배종에서 최소 10 마리의 처녀 여성 자손을 마취하고 수집하십시오. 각 F1 파리에 혈통의 세부 정보가 태그로 지정되고 별도로 저장되는지 확인하십시오. PCR을 위해 파리를 스크리닝하려면 표적 유전자의 편집 부위를 포함하는 약 섭씨 55도의 용융 온도로 프라이머를 설계합니다.
각 플라이 샘플에 대한 용해 완충액을 준비하고 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 10마이크로리터를 분주합니다. 다리 절개 과정 동안 완충액을 차가운 온도로 유지하십시오. 다음으로, 유리 모세관을 준비하고 한쪽 끝을 자당 한천 음식으로 채웁니다.
이 튜브를 플라이 호텔이라고 하는 96웰 깊이의 웰 플레이트에 놓습니다. 다리 절제의 경우 이산화탄소 마취 패드를 실체 현미경 아래에 놓습니다. 후보 파리를 마취시키고 가운데 다리 중 하나를 절단합니다.
그런 다음 다리를 용해 완충액에 담그십시오. 한 쌍의 미세한 금속 집게로 플라이 윙을 잡습니다. 플라이를 플라이 호텔로 옮기고 즉시 실로 튜브를 밀봉하십시오.
섭씨 25도, 습도 60%로 유지되는 통풍이 잘되는 인큐베이터에 플라이 호텔을 수용하십시오. 절단된 다리를 열 순환기의 용해 완충 용액에 담그십시오. 1.5 마이크로리터의 플라이 레그 용해물을 DNA 소스로 사용하여 제조업체의 지시에 따라 PCR 반응을 구성합니다.
PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동에 적용하고 밴드 크기에 따라 결과를 해석합니다. 겔 결과를 바탕으로 플라이 호텔에서 양성 파리를 선택하고 밸런서 파리와 개별적으로 교배하여 F2 세대를 생성합니다. 정확성을 보장하기 위해 편집 부위의 Sanger 염기서열분석에 동형접합 스톡을 사용합니다.
배경 돌연변이를 제거하기 위해 야생형 파리와 백크로스 검증된 플라이 라인. 단일 다리 PCR 프로토콜을 사용하여 각 세대를 스크리닝합니다. 성인 초파리 뇌의 컨포칼 현미경 이미지는 늦은 밤과 이른 아침 시간대에 걸쳐 신중한 핵 병소로 조직된 생리 단백질을 보여주었습니다.
전반적으로, 이 프로토콜은 유전형 분석 PCR 프라이머가 특이적인 경우 강력합니다.
