Целью этого протокола является генерация эндогенной отредактированной линии мухи. В качестве примера мы показываем флуоресцентный нокаут белка, но он также может быть применен к другим нокаутам, нокаутам, а также к генерации мутаций. Наш протокол основан на гомологичной рекомбинации CRISPR, поэтому практически нет ограничений на сайты мутаций.
Более того, наш протокол значительно сократил время и усилия, затрачиваемые на этапы генотипирования. Для начала откройте веб-сайт fly CRISPR, чтобы спроектировать sgRNA для дрозофилы, и введите примерно 100 последовательностей пар оснований, окружающих желаемое место вбивания. Выберите мишени CRISPR с опцией с пятью простыми гуанинами.
Нажмите кнопку найти мишени CRISPR, чтобы сгенерировать список возможных последовательностей sgRNA. Затем нажмите кнопку оценки для каждой последовательности и выберите две сгРНК, которые не имеют отклонений от целей. Поскольку естественные уровни экспрессии белка, как правило, намного ниже, выбирайте флуоресцентные метки, которые являются яркими и фотографическими, и подходят для экспериментальной установки.
Затем разработайте линкер для связывания эпитопных меток с флуоресцентным маркером для биохимического анализа. Используйте пептид-линкер, содержащий от двух до 20 аминокислот, включающий такие аминокислоты, как глицин и серин. Чтобы спроектировать донорский вектор для дрозофилы, организуйте последовательность ДНК пептида-линкера и флуоресцентной метки и обеспечьте гомологичные последовательности, фланкирующие оба конца.
Модифицируйте любые последовательности PAM в донорской плазмиде, чтобы сохранить полученную аминокислотную последовательность белков. Далее расположите начальный и конечный кодоны в зависимости от расположения метки. Для внутреннего мечения убедитесь, что флуоресцентная метка находится в кадре с кодирующей последовательностью целевого гена.
Для мечения N-конца расположите флуоресцентную метку после эндогенного стартового кодона. Для маркировки С-конца расположите флуоресцентную метку перед естественным стоп-кодоном. Убедитесь, что сохранен только один начальный кодон, чтобы избежать потенциальных проблем с переводом.
Используйте альтернативный подход к клонированию на основе фермента рестрикции для вставки последовательности sgRNA в плазмиду U6 Bbs1-chiRNA. После создания плазмиды sgRNA трансформируют плазмиду в DH5-Alpha Escherichia coli в соответствии с инструкциями производителя. Проверьте полученные клоны с помощью секвенирования по Сэнгеру, используя стандартные праймеры секвенирования Т3 или Т7.
Для создания донорской плазмиды используют двухцепочечную ДНК с нужной последовательностью и интегрируют ее в плазмиду Bluesript 2SK отрицательный сайт множественного клонирования. Секвенирование плазмиды-донора, чтобы убедиться, что последовательности sgRNA или PAM правильно модифицированы и в плазмиде отсутствуют SNP. Затем берут мух Cas9, которым вводят сконструированную гРНК и донорские плазмиды.
Обезболивайте мух углекислым газом и отделяйте самцов мух от девственных самок. Чтобы установить скрещивание мух, соедините каждого самца с нулевым уровнем G по крайней мере с двумя девственными самками FM7L в отдельных узких пищевых флаконах CT. Поместите скрещенные флаконы в вентилируемый инкубатор при температуре 25 градусов Цельсия и влажности 60% до тех пор, пока F1 не закроется.
Затем обезболивают и собирают не менее 10 девственных потомков женского пола от скрещивания самцов и самок G zero. Убедитесь, что каждая муха F1 помечена сведениями о ее происхождении и хранится отдельно. Для скрининга мух для ПЦР разработайте праймеры с температурой плавления около 55 градусов по Цельсию, которые охватывают место редактирования целевого гена.
Приготовьте лизисный буфер для каждого образца мухи и выдайте 10 микролитров в каждую лунку 96-луночного ПЦР-планшета. Поддерживайте буфер при низкой температуре во время процесса рассечения ноги. Далее подготовьте стеклянные капиллярные трубочки, заполнив один конец пищей из сахарозо-агара.
Поместите эти трубки в глубокую тарелку глубиной 96 лунок, называемую гостиницей для мух. Для рассечения ноги поместите прокладку для углекислого наркоза под стереомикроскоп. Обезболите муху-кандидата и отрежьте ей одну из средних ног.
После этого погрузите ножку в лизисный буфер. Удерживайте крыло мухи тонкими металлическими щипцами. Переместите муху в гостиницу для мух и сразу же запечатайте трубку пряжей.
Разместите муху в вентилируемом инкубаторе, поддерживаемом при температуре 25 градусов по Цельсию и влажности 60%. Погрузите отрубленные ножки в лизисный буферный раствор в термоамплификаторе. Организуйте реакцию ПЦР в соответствии с инструкциями производителя, используя 1,5 микролитра лизата муховых лапок в качестве источника ДНК.
Подвергнуть продукты ПЦР электрофорезу в агарозном геле и интерпретировать результаты в зависимости от размера полосы. Основываясь на результатах гелевых тестов, выберите положительные мушки из флай-отеля и по отдельности скрестите их с балансирными мухами, чтобы получить поколение F2. Используйте гомозиготные подвои для секвенирования по Сэнгеру сайта редактирования, чтобы обеспечить точность.
Обратное скрещивание линий мух с мухами дикого типа для удаления фоновых мутаций. Скрининг каждого поколения с использованием протокола ПЦР с одной ногой. Конфокальные микроскопические изображения мозга взрослых дрозофил показали, что менструальный белок организован в дискретные ядерные очаги в течение поздней ночи и раннего утра.
В целом, этот протокол надежен, если ваши праймеры для генотипирования ПЦР специфичны.
