Lo scopo di questo protocollo è quello di generare una linea di mosca modificata endogena. Mostriamo come esempio un knock-in di una proteina fluorescente, ma potrebbe anche essere applicato ad altri knock-in, knockout e generazione di mutazioni. Il nostro protocollo è un metodo basato sulla ricombinazione omologa CRISPR, quindi non c'è quasi nessuna restrizione sui siti di mutazione.
Inoltre, il nostro protocollo ha ridotto notevolmente il tempo e l'impegno necessari per le fasi di genotipizzazione. Per iniziare, apri il sito web di CRISPR per progettare sgRNA per Drosophila e inserisci circa 100 sequenze di coppie di basi che circondano la posizione di knock-in desiderata. Seleziona i bersagli CRISPR con l'opzione cinque prime guanina.
Fare clic sul pulsante Trova target CRISPR per generare un elenco di possibili sequenze di sgRNA. Quindi fare clic sul pulsante Valuta per ogni sequenza e scegliere due sgRNA che non hanno bersagli esterni. Poiché i livelli naturali di espressione proteica sono in genere molto più bassi, selezionare tag fluorescenti che siano luminosi e fotostabili e che si adattino alla configurazione sperimentale.
Successivamente, progettare un linker per collegare i tag dell'epitopo al marcatore fluorescente per l'analisi biochimica. Utilizzare un peptide linker che va da due a 20 aminoacidi, comprendente aminoacidi come glicina e serina. Per progettare il vettore donatore per Drosophila, organizzare la sequenza di DNA del peptide linker e del tag fluorescente e garantire sequenze omologhe che fiancheggiano entrambe le estremità.
Modificare qualsiasi sequenza PAM all'interno del plasmide donatore per mantenere la sequenza aminoacidica delle proteine risultante. Quindi, posiziona i codoni di inizio e fine in base alla posizione del tag. Per l'etichettatura interna, assicurarsi che l'etichetta fluorescente sia inquadrata con la sequenza codificante del gene bersaglio.
Per l'etichettatura N-terminale, posizionare il tag fluorescente dopo il codone di inizio endogeno. Per l'etichettatura C-terminale, posizionare l'etichetta fluorescente prima del codone di stop naturale. Assicurarsi di mantenere un solo codone iniziale per evitare potenziali problemi di traduzione.
Utilizzare l'approccio di clonaggio alternativo basato sull'enzima di restrizione per inserire la sequenza di sgRNA nel plasmide U6 Bbs1-chiRNA plasmide. Dopo aver creato il plasmide sgRNA, trasformare il plasmide in DH5-Alpha Escherichia coli secondo le istruzioni del produttore. Verificare i cloni risultanti attraverso il sequenziamento Sanger, utilizzando primer di sequenziamento standard T3 o T7.
Per creare il plasmide donatore, utilizzare il DNA a doppio filamento con la sequenza desiderata e integrarlo nel sito di clonazione multipla negativo del plasmide Bluesript 2SK. Sequenziare il plasmide del donatore per garantire che le sequenze di sgRNA o PAM siano modificate correttamente e che non siano presenti SNP nel plasmide. Successivamente, prendi le mosche Cas9 iniettate con il gRNA costruito e i plasmidi del donatore.
Anestetizzare le mosche con anidride carbonica e separare le mosche maschi dalle femmine vergini. Per stabilire gli incroci di mosca, accoppiare ogni maschio G zero con almeno due femmine vergini FM7L in singole fiale di cibo CT strette. Mettere le fiale incrociate in un'incubatrice ventilata mantenuta a 25 gradi Celsius e al 60% di umidità fino a quando le mosche F1 non si avvicinano.
Quindi anestetizzare e raccogliere almeno 10 figli femminili vergini da incroci maschili e femminili G zero. Assicurati che ogni mosca F1 sia etichettata con i dettagli della sua parentela e conservata separatamente. Per lo screening dei moscerini per la PCR, progettare primer con una temperatura di fusione di circa 55 gradi Celsius che comprendano il sito di editing del gene bersaglio.
Preparare il tampone di lisi per ogni campione di mosca ed erogare 10 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti. Mantenere il tampone a una temperatura fredda durante il processo di dissezione delle gambe. Quindi, prepara i tubi capillari di vetro, riempiendo un'estremità con cibo agar saccarosio.
Posiziona questi tubi in una piastra profonda 96 pozzetti, denominata hotel volante. Per la dissezione delle gambe, posizionare il tampone per anestesia con anidride carbonica sotto uno stereomicroscopio. Anestetizzare una mosca candidata e recidere una delle sue zampe centrali.
Dopodiché, immergi la gamba nel tampone di lisi. Tieni l'ala della mosca con un paio di pinze di metallo fine. Sposta la mosca nell'hotel della mosca e sigilla immediatamente il tubo con il filo.
Ospita l'hotel delle mosche in un'incubatrice ventilata mantenuta a 25 gradi Celsius e al 60% di umidità. Immergere le gambe recise nella soluzione tampone di lisi in un termociclatore. Organizzare la reazione PCR come indicato dal produttore, utilizzando 1,5 microlitri di lisato di zampe di mosca come fonte di DNA.
Sottoporre i prodotti PCR all'elettroforesi su gel di agarosio e interpretare i risultati in base alla dimensione della banda. Sulla base dei risultati del gel, selezionare le mosche positive dall'hotel della mosca e incrociarle singolarmente con le mosche bilanciatrici per produrre la generazione F2. Utilizzare supporti omozigoti per il sequenziamento Sanger del sito di editing per garantire l'accuratezza.
Linee di mosca convalidate all'incrocio con mosche wild type per rimuovere le mutazioni di fondo. Eseguire lo screening di ogni generazione utilizzando il protocollo PCR a gamba singola. Le immagini al microscopio confocale di cervelli adulti di Drosophila hanno mostrato proteine mestruali organizzate in discreti focolai nucleari durante la tarda notte e la mattina presto.
Nel complesso, questo protocollo è robusto se i primer PCR di genotipizzazione sono specifici.
