الغرض من هذا البروتوكول هو إنشاء خط ذبابة محرر داخلي. نعرض ضربة قاضية للبروتين الفلوري كمثال ، ولكن يمكن أيضا تطبيقها على طرق أخرى ، وضربة قاضية ، وكذلك توليد طفرة. بروتوكولنا هو طريقة تعتمد على إعادة التركيب المتماثل كريسبر ، لذلك لا يوجد أي قيود تقريبا على مواقع الطفرات.
علاوة على ذلك ، قلل بروتوكولنا بشكل كبير من الوقت والجهد المبذولين في خطوات التنميط الجيني. للبدء ، افتح موقع CRISPR لتصميم sgRNAs لذبابة الفاكهة ، وأدخل ما يقرب من 100 تسلسل زوج أساسي يحيط بموقع الضربة القاضية المطلوب. حدد أهداف كريسبر مع خيار الجوانين الخمسة الرئيسي.
انقر فوق الزر "البحث عن أهداف كريسبر" لإنشاء قائمة بتسلسلات sgRNA المحتملة. ثم انقر فوق الزر "تقييم" لكل تسلسل ، واختر اثنين من sgRNAs التي لا تحتوي على أي أهداف خارج الأهداف. نظرا لأن مستويات تعبير البروتين الطبيعي عادة ما تكون أقل بكثير ، حدد علامات الفلورسنت الساطعة والقابلة للضوء ، وتناسب الإعداد التجريبي.
بعد ذلك ، صمم رابطا لربط علامات الحواتم بعلامة الفلورسنت للتحليل الكيميائي الحيوي. استخدم ببتيد رابط يتراوح من اثنين إلى 20 من الأحماض الأمينية ، بما في ذلك الأحماض الأمينية مثل الجلايسين والسيرين. لتصميم ناقل المتبرع لذبابة الفاكهة ، قم بتنظيم تسلسل الحمض النووي للببتيد الرابط وعلامة الفلورسنت ، وتأكد من تسلسلات متماثلة تحيط بكلا الطرفين.
قم بتعديل أي تسلسلات PAM داخل بلازميد المتبرع للحفاظ على تسلسل الأحماض الأمينية للبروتينات الناتجة. بعد ذلك، ضع كودونات البداية والإيقاف بناء على موقع العلامة. لوضع العلامات الداخلية ، تأكد من أن علامة الفلورسنت في إطار مع تسلسل الترميز للجين المستهدف.
لوضع علامات N-terminus ، ضع علامة الفلورسنت بعد كودون البدء الداخلي. لوضع علامات C-terminus ، ضع علامة الفلورسنت قبل كودون التوقف الطبيعي. تأكد من الاحتفاظ بكودون بدء واحد فقط لتجنب مشكلات الترجمة المحتملة.
استخدم نهج الاستنساخ البديل القائم على الإنزيم لإدخال تسلسل sgRNA في بلازميد البلازميد U6 Bbs1-chiRNA. بعد إنشاء بلازميد sgRNA ، قم بتحويل البلازميد إلى DH5-Alpha Escherichia coli وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تحقق من النسخ الناتجة من خلال تسلسل سانجر ، باستخدام إما بادئات التسلسل القياسية T3 أو T7.
لإنشاء البلازميد المانح ، استخدم الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل بالتسلسل المطلوب ، وقم بدمجه في موقع الاستنساخ المتعدد السلبي Bluesript 2SK البلازميد. تسلسل البلازميد المتبرع لضمان تعديل تسلسل sgRNA أو PAM بشكل صحيح وعدم وجود SNPs في البلازميد. بعد ذلك ، خذ ذباب Cas9 المحقون بالحمض النووي الريبي المبني والبلازميدات المانحة.
تخدير الذباب بثاني أكسيد الكربون ، وفصل ذكور الذباب والإناث البكر. لإنشاء صلبان ذبابة ، قم بإقران كل ذكر G zero مع اثنين على الأقل من الإناث البكر FM7L في قوارير طعام CT ضيقة فردية. ضع قوارير متقاطعة في حاضنة مهواة يتم الحفاظ عليها عند 25 درجة مئوية ورطوبة 60٪ حتى تطير F1.
ثم تخدير وجمع ما لا يقل عن 10 ذرية عذراء من كل من الصلبان الذكور والإناث G صفر. تأكد من تمييز كل ذبابة F1 بتفاصيل نسبها وتخزينها بشكل منفصل. لفحص الذباب بحثا عن تفاعل البوليميراز المتسلسل ، صمم مواد أولية بدرجة حرارة انصهار تبلغ حوالي 55 درجة مئوية تشمل موقع تحرير الجين المستهدف.
قم بإعداد مخزن التحلل المؤقت لكل عينة ذبابة ، وقم بتوزيع 10 ميكرولتر في كل بئر من لوحة PCR 96 بئرا. حافظ على المخزن المؤقت عند درجة حرارة باردة أثناء عملية تشريح الساق. بعد ذلك ، قم بإعداد أنابيب شعرية زجاجية ، وملء أحد طرفيها بطعام أجار السكروز.
ضع هذه الأنابيب في لوحة بئر عميقة 96 بئرا ، يشار إليها باسم فندق الذبابة. لتشريح الساق ، ضع وسادة تخدير ثاني أكسيد الكربون تحت مجهر ستيريو. تخدير ذبابة مرشحة ، وقطع إحدى ساقيها الوسطى.
بعد ذلك ، اغمر الساق في المخزن المؤقت للتحلل. امسك جناح الذبابة بزوج من الملقط المعدني الناعم. انقل الذبابة إلى فندق الذبابة ، وأغلق الأنبوب بالخيوط على الفور.
ضع فندق الذبابة في حاضنة تهوية يتم الحفاظ عليها عند 25 درجة مئوية ورطوبة 60٪. اغمر الأرجل المقطوعة في محلول التحلل العازل في جهاز تدوير حراري. قم بتنظيم تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، باستخدام 1.5 ميكرولتر من محلول ساق الذبابة كمصدر للحمض النووي.
إخضاع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل للرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز ، وتفسير النتائج بناء على حجم الشريط. بناء على نتائج الهلام ، حدد الذباب الإيجابي من فندق الذباب وعبوره بشكل فردي مع ذباب الموازن لإنتاج جيل F2. استخدم مخزونا متماثل الزيجوت لتسلسل سانجر لموقع التحرير لضمان الدقة.
خطوط ذبابة متقاطعة تم التحقق من صحتها مع ذباب من النوع البري لإزالة طفرات الخلفية. فحص كل جيل باستخدام بروتوكول PCR أحادي الساق. أظهرت صور المجهر متحد البؤر لأدمغة ذبابة الفاكهة البالغة بروتين الدورة الشهرية منظما في بؤر نووية سرية طوال وقت متأخر من الليل ونقاط الصباح الباكر.
بشكل عام ، يكون هذا البروتوكول قويا إذا كانت بادئات التنميط الجيني PCR محددة.
