该方案使用静态悬浮培养策略将胰腺祖细胞分化为胰岛簇，减少细胞在振荡培养过程中所经历的应力，并大大提高分化成功率。硬件协议对初学者友好，并节省了前四个阶段的优化时间。具有基本干细胞培养技术的人员可以重现该协议，并很有可能产生功能性胰岛样簇。
首先，用在冰冷的 DMEM/F12 中稀释的符合 hESC 标准的基质胶预包被培养孔，并将板置于潮湿的 37 摄氏度 5% 二氧化碳培养箱中 30 分钟。从 hPSC 培养物中吸出用过的培养基，并用 DPBS 冲洗一次。用细胞解离酶在37°C下将hPSC培养物解离到单个细胞中，持续3至5分钟。
解离后，通过加入温热的 DMEM/F12 培养基冲洗细胞，并将它们转移到 15 或 50 毫升锥形管中。将细胞悬液以 300 g 离心 5 分钟，并将沉淀重悬于含有 10 微摩尔 Y-27632 的干细胞完全培养基中。然后，使用血细胞计数器进行活细胞计数。
计数后，吸出稀释的基质胶，并立即在基质凝胶包被的孔上以1.6至1.8倍10至每平方厘米密度5%接种活细胞。将细胞在加湿的培养箱中孵育 24 小时。接下来，在第一阶段，第一天，准备阶段 1A 培养基。
用 1A 期培养基替换用过的培养基并孵育 24 小时。第二天，用新鲜制备的1B阶段培养基替换孔中的用过的培养基。在第二阶段，第一天，制备 2A 期培养基，并用 2A 期培养基替换孔中的培养基。
孵育 24 小时，然后将 2B 期培养基加入孔中;第三阶段，第一天，从孔中吸出用过的培养基，然后加入新鲜制备的第 3 阶段培养基并在加湿培养箱中孵育。在第 4 阶段，第 1 天，用新鲜制备的第 4 阶段培养基替换用过的培养基，并在加湿培养箱中孵育。在第四阶段，第五天，每孔用 500 微升抗粘附冲洗液预处理微孔。
将微孔板以1， 300 G离心五分钟，并在显微镜下观察，以确保微孔中没有气泡。接下来，从孔中吸出冲洗液，并用一毫升DPBS冲洗一次。然后，向每个孔中加入一毫升聚集介质。
从胰腺祖细胞培养物中取出用过的培养基后，用DPBS洗涤培养物一次，然后用解离试剂在37摄氏度下解离成单细胞10至12分钟。用温热的DMEM / F12冲洗细胞，并将它们转移到试管中以300G离心五分钟。将沉淀重悬于聚集培养基中并进行活细胞计数。
每孔接种 2.4 至 360 万个细胞，并向每个孔中加入聚集培养基，以达到每孔 2 毫升的最终体积。使用 P-1000 移液器吸头，轻轻上下移液细胞以使其均匀分布。将细胞悬液以 300 g 离心 5 分钟以捕获微孔中的细胞，并在加湿培养箱中孵育 24 小时以开始聚集。
聚集后，轻轻地上下移液聚集体几次，以浮动任何未聚集的细胞。一旦聚集体沉降，小心地除去含有漂浮的非聚集细胞的废培养基，而没有吸出聚集体。将新鲜的阶段 5 培养基分配到微孔板的表面上，以从微孔中去除聚集体，并将它们转移到超低附着的六孔板中。
在超低附着的六孔中收集所有聚集体后，将它们重悬于第 5 阶段培养基中，以将密度调节至每 100 微升 20 个簇。然后，使用多通道移液器，将 50 微升 5 期培养基分配到超低附着 ULA 平底 96 孔板的每个孔中。用 200 微升 DPBS 填充角孔和边缘孔。
每次分液前轻轻混合簇重悬液。然后，将 100 微升簇重悬液加入 ULA 平底 96 孔板的每个孔中。将培养板放在加湿培养箱的水平表面上 24 小时。
第二天或第五阶段，第二天，使用多通道移液器，从每个孔中轻轻取出 90 微升用过的培养基，并用 100 微升的第 5 阶段培养基刷新。在第六阶段，第一天，每孔用 100 微升第 6 阶段培养基替换 90 微升用过的培养基。在第 7 阶段，第 1 天，取出用过的培养基，每孔加入 100 微升第 7 阶段培养基。
在这项研究中，使用微孔板，一次生成数千个大小和形态均匀的胰祖细胞簇，平均聚集效率约为 74%，重要的是，PDX1 和 NKX6.1 的表达在这些簇中保持高水平聚集后。胰岛素表达细胞在内分泌簇内逐渐被诱导，如活培养物中胰岛素GFP信号随时间增加所表明的那样。在第五阶段和第七阶段之间，簇的大小从平均直径 150 微米增加到 220 微米。
细胞组成的表征表明，混合方案产生的第七阶段 hPSC 胰岛主要是内分泌的，由四种主要的胰岛细胞类型组成。这种混合方案主要产生单激素胰岛细胞和少数双激素细胞。分化 β 细胞表达 NKX6.1、MAFA、NEUROD1、PDX1 和 GLUT1。
此外，在第七阶段培养中诱导了 60% 胰岛素和 PDX1 双阳性细胞以及 50% C 肽和 NKX6.1 双阳性细胞。在体外，静态葡萄糖刺激的胰岛素分泌试验表明，第七阶段 hPSC 胰岛分泌高胰岛素水平以响应高葡萄糖和直接去极化。hPSC胰岛的总胰岛素含量约为尸体胰岛的一半。
用于生成干细胞来源胰岛的多孔静态培养系统有助于各种原位检测，并可作为方案开发和小规模筛选研究的合适平台。为了在 96 孔板中静态培养期间尽量减少簇融合，在进行培养基更换时不要倾斜板。始终将板水平保持在水平表面上。
