Bu protokol, pankreas progenitörlerini adacık kümelerine ayırmak için statik bir süspansiyon kültürü stratejisi kullanır, hücrelerin çalkalama kültürü sırasında yaşadığı stresleri azaltır ve farklılaşma başarısını büyük ölçüde artırır. Donanım protokolü yeni başlayanlar için uygundur ve ilk dört aşamanın optimizasyonu için zaman kazandırır. Temel kök hücre kültürü tekniklerine sahip personel, bu protokolü fonksiyonel adacık benzeri kümeler oluşturma şansı ile yeniden üretebilir.
Başlamak için, buz gibi soğuk DMEM/F12 ile seyreltilmiş hESC nitelikli matrigel ile ön kaplama kültür kuyuları ve plakayı 30 dakika boyunca nemlendirilmiş 37 santigrat derece %5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Harcanan ortamı hPSC kültüründen aspire edin ve DPBS ile bir kez durulayın. hPSC kültürünü, üç ila beş dakika boyunca 37 santigrat derecede hücre ayrışma enzimi ile tek hücrelere ayırın.
Ayrışmadan sonra, ılık DMEM / F12 ortamı ekleyerek hücreleri durulayın ve bunları 15 veya 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin ve peleti 10 mikromolar Y-27632 içeren bir kök hücre tam ortamında yeniden süspanse edin. Ardından, bir hemositometre kullanarak canlı hücre sayımı yapın.
Aspire edildikten sonra, seyreltilmiş matrijel ve hemen canlı hücrelerin 1.6 ila 1.8 katında, 10 ila beş ila beş arasında matrigel kaplı kuyucuklarda tohumlayın. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 24 saat inkübe edin. Ardından, birinci aşamada, birinci gün, 1A ortamını hazırlayın.
Harcanan ortamı aşama 1A ortamı ile değiştirin ve 24 saat inkübe edin. Ertesi gün, kuyulardan harcanan ortamı taze hazırlanmış aşama 1B ortamı ile değiştirin. İkinci aşamada, birinci gün, aşama 2A ortamını hazırlayın ve ortamı kuyulardan aşama 2A ortamıyla değiştirin.
Kuyucuklara aşama 2B ortamı eklemeden önce 24 saat inkübe edin; Üçüncü aşama, birinci gün, harcanan ortamı kuyulardan aspire edin, ardından taze hazırlanmış 3. aşama ortamını ekleyin ve nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. Dördüncü aşamada, birinci gün, kullanılmış ortamı yeni hazırlanmış 4. aşama ortamıyla değiştirin ve nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. Dördüncü aşamada, beşinci günde, mikro kuyucuklara kuyucuk başına 500 mikrolitre yapışma önleyici durulama solüsyonu uygulayın.
Mikrokuyu plakasını beş dakika boyunca 1.300 G'de santrifüjleyin ve mikro kuyularda hava kabarcığı kalmadığından emin olmak için mikroskop altında gözlemleyin. Daha sonra, durulama solüsyonunu kuyulardan aspire edin ve bir mililitre DPBS ile bir kez durulayın. Ardından, her kuyucuğa bir mililitre toplama ortamı ekleyin.
Harcanan ortamı pankreas progenitör kültürlerinden çıkardıktan sonra, 10 ila 12 dakika boyunca 37 santigrat derecede ayrışma reaktifi ile tek hücrelere ayrılmadan önce kültürü bir kez DPBS ile yıkayın. Hücreleri ılık DMEM / F12 ile durulayın ve beş dakika boyunca 300 G'de santrifüjleme için bir tüpe aktarın. Peleti agregasyon ortamında yeniden süspanse edin ve canlı hücre sayımı gerçekleştirin.
Oyuk başına 2.4 ila 3.6 milyon hücre tohumlayın ve oyuk başına iki mililitrelik bir nihai hacim elde etmek için her oyuğa bir toplama ortamı ekleyin. Bir P-1000 pipet ucu kullanarak, eşit dağılım için hücreleri nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Mikro kuyulardaki hücreleri yakalamak için hücre süspansiyonunu 300 G'de beş dakika santrifüjleyin ve agregasyonu başlatmak için 24 saat boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
Toplamadan sonra, toplanmamış hücreleri yüzdürmek için agregaları birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Agregalar çökeldikten sonra, aspire etmeden yüzen agrega olmayan hücreler içeren harcanan ortamı dikkatlice çıkarın. Agregaları mikro kuyulardan çıkarmak için taze aşama 5 ortamını mikro kuyu plakasının yüzeyine dağıtın ve bunları ultra düşük bağlantılı altı kuyulu plakaya aktarın.
Tüm agregaları ultra düşük bağlantılı altı kuyuda topladıktan sonra, yoğunluğu 100 mikrolitre başına 20 kümeye ayarlamak için bunları 5. aşama ortamında yeniden süspanse edin. Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak, ultra düşük ataşmanlı ULA düz tabanlı 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 50 mikrolitre aşama 5 ortamı dağıtın. Köşe ve kenar kuyularını 200 mikrolitre DPBS ile doldurun.
Dağıtmadan önce her seferinde küme süspansiyonunu yavaşça karıştırın. Ardından, ULA düz tabanlı 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre küme yeniden süspansiyonu ekleyin. Kültür plakalarını 24 saat boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde düz bir yüzeye yerleştirin.
Ertesi gün veya beşinci aşamada, ikinci gün, çok kanallı bir pipet kullanarak, harcanan ortamın 90 mikrolitresini her bir oyuktan nazikçe çıkarın ve 100 mikrolitre aşama 5 ortamı ile yenileyin. Altıncı aşamada, birinci gün, 90 mikrolitre kullanılmış ortamı, kuyu başına 100 mikrolitre 6. aşama ortamı ile değiştirin. Yedinci aşamada, birinci gün, harcanan ortamı çıkarın ve kuyucuk başına 100 mikrolitre aşama 7 ortamı ekleyin.
Bu çalışmada, mikrokuyu plakaları kullanılarak, bir seferde tek tip boyut ve morfolojiye sahip binlerce pankreas progenitör kümesi oluşturuldu ve ortalama agregasyon verimliliği %74 civarındaydı Daha da önemlisi, PDX1 ve NKX6.1'in ekspresyonu, agregasyon sonrası bu kümelerde yüksek seviyelerde tutuldu. İnsülin eksprese eden hücreler, zaman içinde canlı kültürlerde artan insülin GFP sinyalleri ile gösterildiği gibi, endokrin kümeleri içinde kademeli olarak indüklendi. Küme boyutu, beşinci ve yedinci aşamalar arasında ortalama 150 mikron çaptan 220 mikrona çıkar.
Hücre kompozisyonunun karakterizasyonu, hibrid protokol tarafından üretilen yedinci evre hPSC adacıklarının öncelikle endokrin olduğunu ve dört ana adacık hücre tipinden oluştuğunu göstermektedir. Bu hibrid protokol, büyük ölçüde monohormonal adacık hücreleri ve bihormonal hücrelerin azınlığını üretti. Farklılaşan beta hücreleri NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 ve GLUT1'i eksprese eder.
Ayrıca, yedinci aşama kültürlerde %60 insülin ve PDX1 çift pozitif hücreler ve %50 C-peptid ve NKX6.1 çift pozitif hücreler indüklendi. İn vitro, statik glukoz ile uyarılmış insülin sekresyonu deneyleri, evre yedi hPSC adacıklarının yüksek glukoz ve doğrudan depolarizasyona yanıt olarak yüksek insülin seviyeleri salgıladığını göstermiştir. hPSC adacıklarının toplam insülin içeriği, kadavra adacıklarının yaklaşık yarısı kadardır.
Kök hücre kaynaklı adacıklar oluşturmak için çok kuyulu tabanlı statik kültür sistemi, çeşitli in situ tahlilleri kolaylaştırır ve protokol geliştirme ve küçük ölçekli tarama çalışmaları için uygun bir platform görevi görebilir. 96 oyuklu plakada statik bir kültür sırasında küme füzyonunu en aza indirmek için, ortam değişimini gerçekleştirirken plakayı eğmeyin. Plakayı her zaman düz bir yüzeyde yatay tutun.
