يستخدم هذا البروتوكول استراتيجية زراعة تعليق ثابتة للتمييز بين أسلاف البنكرياس إلى مجموعات جزرية ، ويقلل من الضغوط التي تتعرض لها الخلايا أثناء ثقافة الاهتزاز ، ويحسن بشكل كبير من نجاح التمايز. بروتوكول الأجهزة سهل الاستخدام للمبتدئين ، ويوفر الوقت لتحسين المراحل الأربع الأولى. يمكن للأفراد الذين لديهم تقنيات زراعة الخلايا الجذعية الأساسية إعادة إنتاج هذا البروتوكول مع فرصة جيدة لتوليد مجموعات وظيفية تشبه الجزر.
للبدء ، قم بطلاء الآبار باستخدام مادة معتمدة من hESC مخففة في DMEM / F12 بارد الجليد وضع اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون رطبة 37 درجة مئوية 5٪ لمدة 30 دقيقة. نضح الوسيط المستهلك من ثقافة hPSC واشطفه مرة واحدة باستخدام DPBS. افصل ثقافة hPSC إلى خلايا مفردة باستخدام إنزيم تفكك الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق.
بعد التفكك ، اشطف الخلايا بإضافة وسط DMEM / F12 الدافئ وانقلها إلى أنبوب مخروطي 15 أو 50 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية عند 300 G لمدة خمس دقائق وإعادة تعليق الحبيبات في وسط كامل للخلايا الجذعية يحتوي على 10 ميكرومولار Y-27632. بعد ذلك ، قم بإجراء عد الخلايا الحية باستخدام مقياس الدم.
بعد عد نضح الماتريجل المخفف وزرع الخلايا الحية على الفور عند 1.6 إلى 1.8 مرة 10 إلى كثافة خمسة لكل سنتيمتر مربع على الآبار المطلية بماتريجيل. احتضان الخلايا في حاضنة رطبة لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، في المرحلة الأولى ، اليوم الأول ، قم بإعداد المرحلة 1A المتوسطة.
استبدل الوسط المستهلك بالمرحلة 1A المتوسطة واحتضانها لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، استبدل الوسط المستهلك من الآبار بوسط المرحلة 1B المعد حديثا. في المرحلة الثانية ، اليوم الأول ، قم بإعداد وسط المرحلة 2A واستبدل الوسط من الآبار بوسط المرحلة 2A.
احتضان لمدة 24 ساعة قبل إضافة المرحلة 2B المتوسطة في الآبار ؛ المرحلة الثالثة ، اليوم الأول ، تستنشق الوسط المستهلك من الآبار ، ثم تضاف المرحلة 3 الطازجة المتوسطة وتحتضن في حاضنة مرطبة. في المرحلة الرابعة ، اليوم الأول ، استبدل الوسط المستهلك بوسط المرحلة 4 الطازج واحتضانه في حاضنة مرطبة. في المرحلة الرابعة ، اليوم الخامس ، قم بمعالجة الآبار الدقيقة مسبقا ب 500 ميكرولتر من محلول الشطف المضاد للالتصاق لكل بئر.
قم بطرد لوحة microwell عند 1،300 G لمدة خمس دقائق وراقبها تحت المجهر لضمان عدم وجود فقاعات هواء محاصرة في الآبار الدقيقة. بعد ذلك ، قم باستنشاق محلول الشطف من الآبار وشطفه مرة واحدة باستخدام ملليلتر واحد من DPBS. ثم أضف ملليلتر واحد من وسط التجميع إلى كل بئر.
بعد إزالة الوسط المستهلك من مزارع السلف البنكرياسية ، اغسل المزرعة مرة واحدة باستخدام DPBS قبل الانفصال إلى خلايا مفردة مع كاشف التفكك عند 37 درجة مئوية لمدة 10 إلى 12 دقيقة. شطف الخلايا مع DMEM / F12 الدافئ ونقلها إلى أنبوب للطرد المركزي في 300 غرام لمدة خمس دقائق. أعد تعليق الحبيبات في وسط التجميع وقم بإجراء عد الخلايا الحية.
قم بزرع 2.4 إلى 3.6 مليون خلية لكل بئر وإضافة وسط تجميع لكل بئر لتحقيق حجم نهائي يبلغ 2 ملليلتر لكل بئر. باستخدام طرف ماصة P-1000 ، قم بسحب الخلايا برفق لأعلى ولأسفل للتوزيع المتساوي. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية عند 300 G لمدة خمس دقائق لالتقاط الخلايا في microwells واحتضانها في حاضنة رطبة لمدة 24 ساعة لبدء التجميع.
بعد التجميع ، قم بسحب الركام برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات لتعويم أي خلايا غير مجمعة. بمجرد استقرار الركام ، قم بإزالة الوسط المستهلك الذي يحتوي على خلايا عائمة غير مجمعة بعناية دون استنشاق الركام. قم بتوزيع وسط المرحلة 5 الطازج على سطح لوحة microwell لإزاحة الركام من الآبار الدقيقة ، ونقلها إلى لوحة ستة آبار منخفضة التعلق.
بعد جمع جميع الركام في الآبار الستة ذات الارتباط المنخفض للغاية ، أعد تعليقها في وسط المرحلة 5 لضبط الكثافة إلى 20 مجموعة لكل 100 ميكرولتر. بعد ذلك ، باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بتوزيع 50 ميكرولترا من وسط المرحلة 5 في كل بئر من لوحة ULA ذات القاع المسطح ذات القاع المنخفض للغاية والتي يبلغ عدد الآبار 96 بئرا. املأ آبار الزاوية والحافة ب 200 ميكرولتر من DPBS.
امزج إعادة تعليق الكتلة برفق في كل مرة قبل الاستغناء. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من إعادة التعليق العنقودي في كل بئر من لوحة ULA ذات القاع المسطح ذات القاع 96 بئرا. ضع ألواح الاستزراع على سطح مستو في حاضنة مرطبة لمدة 24 ساعة.
في اليوم التالي أو في المرحلة الخامسة ، اليوم الثاني ، باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بإزالة 90 ميكرولترا من الوسط المستهلك برفق من كل بئر وقم بالتحديث ب 100 ميكرولتر من وسط المرحلة 5. في المرحلة السادسة ، اليوم الأول ، استبدل 90 ميكرولترا من الوسط المستهلك ب 100 ميكرولتر من وسط المرحلة 6 لكل بئر. في المرحلة السابعة ، اليوم الأول ، قم بإزالة الوسط المستهلك وأضف 100 ميكرولتر من المرحلة 7 المتوسطة لكل بئر.
في هذه الدراسة ، باستخدام ألواح microwell ، تم إنشاء الآلاف من مجموعات السلف البنكرياسية ذات الحجم الموحد والتشكل في وقت واحد ، وكان متوسط كفاءة التجميع حوالي 74٪ ، والأهم من ذلك ، تم الحفاظ على التعبير عن PDX1 و NKX6.1 عند مستويات عالية في هذه المجموعات بعد التجميع. تم تحفيز الخلايا المعبرة عن الأنسولين تدريجيا داخل مجموعات الغدد الصماء ، كما يتضح من زيادة إشارات الأنسولين GFP في الثقافات الحية بمرور الوقت. يزيد حجم الكتلة من متوسط قطر 150 ميكرون إلى 220 ميكرون بين المرحلتين الخامسة والسابعة.
يظهر توصيف تكوين الخلية أن المرحلة السابعة من جزر hPSC الناتجة عن البروتوكول الهجين كانت في المقام الأول من الغدد الصماء ، وتتألف من أربعة أنواع رئيسية من الخلايا الجزرية. ولد هذا البروتوكول الهجين خلايا جزرية أحادية الهرمونات إلى حد كبير وأقلية من الخلايا ثنائية الهرمونات. يعبر تمايز خلايا بيتا عن NKX6.1 و MAFA و NEUROD1 و PDX1 و GLUT1.
علاوة على ذلك ، تم تحفيز 60٪ من الأنسولين والخلايا الإيجابية المزدوجة PDX1 و 50٪ من الببتيد C والخلايا الإيجابية المزدوجة NKX6.1 في مزارع المرحلة السابعة. في المختبر ، أظهرت فحوصات إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز الثابت أن المرحلة السابعة من جزر hPSC تفرز مستويات عالية من الأنسولين استجابة لارتفاع الجلوكوز وإزالة الاستقطاب المباشر. يبلغ إجمالي محتوى الأنسولين في جزر hPSC حوالي نصف كمية الجزر الجثثية.
يسهل نظام الاستزراع الثابت متعدد الآبار لتوليد الجزر المشتقة من الخلايا الجذعية العديد من المقايسات في الموقع ، ويمكن أن يكون بمثابة منصة مناسبة لتطوير البروتوكول ودراسات الفحص على نطاق صغير. لتقليل الانصهار العنقودي أثناء الثقافة الثابتة في لوحة 96 بئرا ، لا تقم بإمالة اللوحة عند إجراء التغيير المتوسط. احتفظ دائما باللوحة أفقية على سطح مستو.
