Este protocolo usa uma estratégia de cultura de suspensão estática para diferenciar progenitores pancreáticos em aglomerados de ilhotas, reduz os estresses que as células experimentam durante a cultura de agitação e melhora consideravelmente o sucesso da diferenciação. O protocolo de hardware é amigável para iniciantes e economiza tempo para otimização dos quatro primeiros estágios. Pessoal com técnicas básicas de cultura de células-tronco pode reproduzir esse protocolo com uma boa chance de gerar aglomerados funcionais semelhantes a ilhotas.
Para começar, pré-revestir poços de cultura com matrigel qualificado para hESC diluído em DMEM/F12 gelado e colocar a placa em uma incubadora umidificada de dióxido de carbono a 5% de 37 graus Celsius por 30 minutos. Aspirar o meio gasto da cultura hPSC e enxaguar uma vez com DPBS. Dissociar a cultura de hPSC em células únicas com enzima de dissociação celular a 37 graus Celsius por três a cinco minutos.
Após a dissociação, enxaguar as células adicionando meio DMEM/F12 quente e transferi-las para um tubo cônico de 15 ou 50 mililitros. Centrifugar a suspensão celular a 300 G por cinco minutos e ressuspender o pellet em meio completo de células-tronco contendo 10-micromolares Y-27632. Em seguida, realizar a contagem de células vivas usando um hemocitômetro.
Após a contagem aspirada, matrigel diluído e imediatamente semear células vivas a 1,6 a 1,8 vezes 10 a cinco por centímetro quadrado de densidade em poços revestidos com matrigel. Incubar as células em estufa umidificada por 24 horas. Em seguida, no estágio um, primeiro dia, prepare o meio estágio 1A.
Substitua o meio gasto pelo meio estágio 1A e incube por 24 horas. No dia seguinte, substitua o meio gasto dos poços por meio estágio 1B recém-preparado. No estágio dois, primeiro dia, prepare o meio estágio 2A e substitua o meio dos poços pelo meio do estágio 2A.
Incubar por 24 horas antes de adicionar meio estágio 2B nos poços; Um estágio três, primeiro dia, aspirar o meio gasto de poços, em seguida, adicionar o meio estágio 3 recém-preparado e incubar em uma incubadora umidificada. No estágio quatro, primeiro dia, substitua o meio gasto pelo meio estágio 4 recém-preparado e incube em uma incubadora umedecida. Na fase quatro, dia cinco, pré-tratar os micropoços com 500 microlitros de solução de enxágue antiaderente por poço.
Centrifugar a placa de micropoço a 1.300 G por cinco minutos e observar sob um microscópio para garantir que nenhuma bolha de ar fique presa em micropoços. Em seguida, aspirar a solução de enxágue dos poços e enxaguar uma vez com um mililitro de DPBS. Em seguida, adicione um mililitro de meio de agregação a cada poço.
Após a remoção do meio gasto das culturas de progenitores pancreáticos, lavar a cultura uma vez com DPBS antes de dissociar em células únicas com reagente de dissociação a 37 graus Celsius por 10 a 12 minutos. Enxaguar as células com DMEM/F12 quente e transferi-las para um tubo para centrifugação a 300 G por cinco minutos. Ressuspenda o pellet no meio de agregação e realize a contagem de células vivas.
Semeando de 2,4 a 3,6 milhões de células por poço e adicionando um meio de agregação a cada poço para atingir um volume final de dois mililitros por poço. Usando uma ponta de pipeta P-1000, pipete suavemente as células para cima e para baixo para uma distribuição uniforme. Centrifugar a suspensão celular a 300 G por cinco minutos para capturar as células nos micropoços e incubar em estufa umidificada por 24 horas para iniciar a agregação.
Após a agregação, pipetar suavemente os agregados para cima e para baixo várias vezes para flutuar quaisquer células não agregadas. Uma vez que os agregados se assentem, remova cuidadosamente o meio gasto contendo células flutuantes não agregadas sem aspirar agregados. Distribua o meio de estágio 5 fresco na superfície da placa de micropoço para desalojar os agregados dos micropoços e transfira-os para a placa de seis poços de fixação ultrabaixa.
Após a coleta de todos os agregados nos seis poços de ultra baixa fixação, ressuspenda-os no meio estágio 5 para ajustar a densidade para 20 cachos por 100 microlitros. Em seguida, usando uma pipeta multicanal, distribua 50 microlitros de meio estágio 5 em cada poço de uma placa de fundo plano ULA de fundo plano de 96 poços de fixação ultrabaixa. Preencha os poços de canto e borda com 200 microlitros de DPBS.
Misture suavemente a ressuspensão do cluster todas as vezes antes de dispensar. Em seguida, adicione 100 microlitros da ressuspensão do cluster em cada poço da placa ULA de fundo plano de 96 poços. Colocar as placas de cultura em superfície plana em estufa umidificada por 24 horas.
No dia seguinte ou no estágio cinco, dia dois, usando uma pipeta multicanal, remova suavemente 90 microlitros do meio gasto de cada poço e refresque com 100 microlitros do meio estágio 5. Na etapa seis, primeiro dia, substitua os 90 microlitros do meio gasto por 100 microlitros do meio estágio 6 por poço. Na fase sete, primeiro dia, retire o meio gasto e adicione 100 microlitros de meio estágio 7 por poço.
Neste estudo, usando placas de micropoços, milhares de grupos de progenitores pancreáticos com tamanho e morfologia uniformes foram gerados ao mesmo tempo, e a eficiência média de agregação foi de cerca de 74%Importante, a expressão de PDX1 e NKX6.1 foi mantida em níveis elevados nesses agrupamentos após a agregação. As células que expressam insulina foram gradualmente induzidas dentro de grupos endócrinos, como indicado pelo aumento dos sinais de GFP de insulina em culturas vivas ao longo do tempo. O tamanho do aglomerado aumenta de um diâmetro médio de 150 mícrons para 220 mícrons entre os estágios cinco e sete.
A caracterização da composição celular mostra que as ilhotas hPSC do estágio sete geradas pelo protocolo híbrido foram primariamente endócrinas, e compostas por quatro tipos principais de ilhotas. Este protocolo híbrido gerou em grande parte células monohormonais das ilhotas e uma minoria de células bihormonais. As células beta diferenciadoras expressam NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 e GLUT1.
Além disso, células duplamente positivas de insulina e PDX1 a 60% e células duplamente positivas com peptídeo C a 50% e células duplamente positivas para NKX6.1 foram induzidas em culturas de estágio sete. In vitro, ensaios estáticos de secreção de insulina estimulada por glicose demonstraram que as ilhotas hPSC estágio sete secretam altos níveis de insulina em resposta à glicose elevada e à despolarização direta. O conteúdo total de insulina das ilhotas hPSC é aproximadamente metade da quantidade de ilhotas cadavéricas.
O sistema de cultura estática multipoços para geração de ilhotas derivadas de células-tronco facilita vários ensaios in situ e pode servir como uma plataforma adequada para o desenvolvimento de protocolos e estudos de triagem em pequena escala. Para minimizar a fusão do cluster durante uma cultura estática em placa de 96 poços, não incline a placa ao realizar a troca do meio. Mantenha sempre a placa na horizontal sobre uma superfície plana.
