このプロトコルは膵臓の祖先を膵島の集りに区別するために静的な懸濁液文化作戦を使用し、細胞が文化を振とうの間に経験する圧力を減らし、微分の成功を非常に改善する。ハードウェアプロトコルは初心者にやさしく、最初の4つのステージを最適化するための時間を節約できます。基本的な幹細胞培養技術を持つ担当者は、機能的な膵島様のクラスターを生成する可能性が十分にあるこのプロトコルを再現できます。
まず、氷冷DMEM/F12で希釈したhES修飾マトリゲルで培養ウェルをプレコートし、プレートを加湿した摂氏37度5%二酸化炭素インキュベーターに30分間入れます。使用済みの培地をhPS細胞培養液から吸引し、DPBSで一度すすぎます。hPS細胞培養液を細胞解離酵素を用いて、37°Cで3〜5分間、単一細胞に解離します。
解離後、温かいDMEM/F12培地を加えて細胞をすすぎ、15ミリリットルまたは50ミリリットルのコニカルチューブに移します。細胞懸濁液を300 Gで5分間遠心分離し、10マイクロモルY-27632を含む幹細胞完全培地にペレットを再懸濁します。次に、血球計算盤を使用して生細胞カウントを行います。
希釈したマトリゲルを計数した後、マトリゲルでコーティングされたウェルに10倍の密度の1.6〜1.8倍で生細胞を5平方センチメートルの密度で直ちに播種します。加湿したインキュベーターで細胞を24時間インキュベートします。次に、ステージ1の1日目に、ステージ1A培地を準備します。
使用済みの培地をステージ1Aの培地と交換し、24時間インキュベートします。翌日、ウェルからの使用済み培地を、新たに調製したステージ1B培地と交換します。ステージ2の1日目に、ステージ2A培地を調製し、ウェルからの培地をステージ2A培地と交換します。
24時間インキュベートしてから、ステージ2B培地をウェルに添加します。ステージ3の1日目は、使用済みの培地をウェルから吸引し、次に新たに調製したステージ3の培地を加え、加湿したインキュベーターでインキュベートします。ステージ4の1日目に、使用済みの培地を新しく調製したステージ4の培地と交換し、加湿したインキュベーターでインキュベートします。ステージ 4 の 5 日目に、ウェルあたり 500 マイクロリットルの付着防止リンス溶液でマイクロウェルを前処理します。
マイクロウェルプレートを 1, 300 G で 5 分間遠心分離し、顕微鏡で観察して、マイクロウェルに気泡が閉じ込められていないことを確認します。次に、ウェルからリンス液を吸引し、1ミリリットルのDPBSで1回すすぎます。次に、各ウェルに1ミリリットルの凝集培地を添加します。
使用済み培地を膵前駆細胞培養物から除去した後、培養液をDPBSで一度洗浄した後、解離試薬で10〜12分間、解離試薬で単一細胞に解離します。細胞を温かいDMEM/F12で洗浄し、チューブに移して300 Gで5分間遠心分離します。ペレットを凝集培地に再懸濁し、生細胞計数を行います。
ウェルあたり240万〜360万個の細胞を播種し、各ウェルに凝集培地を添加して、ウェルあたり2ミリリットルの最終容量を達成します。P-1000ピペットチップを使用して、細胞を上下に静かにピペットで固定し、均等に分配します。細胞懸濁液を300 Gで5分間遠心分離してマイクロウェル内の細胞を捕捉し、加湿したインキュベーターで24時間インキュベートして凝集を開始します。
凝集後、凝集体を数回静かにピペットで上下させて、凝集していない細胞を浮かせます。凝集体が落ち着いたら、凝集体を吸引せずに浮遊していない凝集細胞を含む使用済み培地を慎重に除去します。新しいステージ5培地をマイクロウェルプレートの表面に分注して、マイクロウェルから凝集体を除去し、超低付着の6ウェルプレートに移します。
すべての凝集体を超低付着性の6ウェルに集めた後、ステージ5培地に再懸濁して、密度を100マイクロリットルあたり20クラスターに調整します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、50マイクロリットルのステージ5培地を超低アタッチメントULA平底96ウェルプレートの各ウェルに分注します。コーナーウェルとエッジウェルに200マイクロリットルのDPBSを充填します。
分注する前に、毎回クラスター再懸濁液を穏やかに混合してください。次に、100マイクロリットルのクラスター再懸濁液をULA平底96ウェルプレートの各ウェルに加えます。培養プレートを加湿したインキュベーターの平らな面に24時間置きます。
翌日またはステージ5、2日目に、マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルから90マイクロリットルの使用済み培地を静かに取り出し、ステージ5培地の100マイクロリットルでリフレッシュします。ステージ 6 の 1 日目に、ウェルあたり 90 マイクロリットルの使用済み培地をステージ 6 培地 100 マイクロリットルと交換します。ステージ7の1日目に、使用済みの培地を取り除き、ウェルあたり100マイクロリットルのステージ7培地を追加します。
本研究では、マイクロウェルプレートを用いて、均一な大きさと形態を有する数千個の膵臓前駆細胞クラスターを一度に作製し、平均凝集効率が約74%であったことは、これらのクラスターにおいて、凝集後のPDX1およびNKX6.1の発現が高レベルで維持されたことである。インスリン発現細胞は、時間の経過とともに生きた培養物におけるインスリンGFPシグナルの増加によって示されるように、内分泌クラスター内で徐々に誘導されました。クラスターのサイズは、ステージ 5 と 7 の間で平均直径 150 ミクロンから 220 ミクロンに増加します。
細胞組成の特性評価から、ハイブリッドプロトコルによって作製されたステージ7のhPS細胞は、主に内分泌であり、4つの主要な膵島細胞タイプから構成されていることが示されました。このハイブリッドプロトコルは、主に単ホルモン性膵島細胞と少数のバイホルモン細胞を生成しました。分化したベータ細胞は、NKX6.1、MAFA、NEUROD1、PDX1、およびGLUT1を発現します。
さらに、ステージ7の培養では、60%のインスリンとPDX1の二重陽性細胞と50%のC-ペプチドとNKX6.1の二重陽性細胞が誘導されました。In vitroでは、静的グルコース刺激インスリン分泌アッセイにより、ステージ7のhPS細胞膵島が高グルコースと直接的な脱分極に応答して高レベルのインスリンを分泌することが実証されました。ヒトPS細胞膵島の総インスリン含量は、死体膵島の約半分です。
幹細胞由来の膵島を作製するためのマルチウェルベースの静的培養システムは、さまざまなin situアッセイを容易にし、プロトコル開発や小規模スクリーニング研究に適したプラットフォームとして役立ちます。96ウェルプレートでの静的培養中のクラスター融合を最小限に抑えるため、培地交換を行う際にプレートを傾けないでください。プレートは常に平らな面で水平に保ちます。
