Ce protocole utilise une stratégie de culture en suspension statique pour différencier les progéniteurs pancréatiques en grappes d’îlots pancréatiques, réduit les contraintes subies par les cellules lors de la culture par agitation et améliore considérablement le succès de la différenciation. Le protocole matériel est convivial pour les débutants et permet de gagner du temps pour l’optimisation des quatre premières étapes. Le personnel ayant des techniques de base de culture de cellules souches peut reproduire ce protocole avec de bonnes chances de générer des amas fonctionnels en forme d’îlots.
Pour commencer, pré-enrobez les puits de culture avec du matrigel qualifié hESC dilué dans du DMEM/F12 glacé et placez la plaque dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Aspirez le milieu usé de la culture hPSC et rincez une fois avec du DPBS. Dissocier la culture de hPSC en cellules individuelles avec une enzyme de dissociation cellulaire à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes.
Après dissociation, rincez les cellules en ajoutant du milieu DMEM/F12 chaud et transférez-les dans un tube conique de 15 ou 50 millilitres. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 G pendant cinq minutes et remettre la pastille en suspension dans un milieu complet de cellules souches contenant 10 micromolaires Y-27632. Ensuite, effectuez le comptage des cellules vivantes à l’aide d’un hémocytomètre.
Après comptage, aspirer le matrigel dilué et ensemencer immédiatement les cellules vivantes à raison de 1,6 à 1,8 fois 10 à la densité de cinq par centimètre carré sur les puits recouverts de matrigel. Incubez les cellules dans un incubateur humidifié pendant 24 heures. Ensuite, à la première étape, le premier jour, préparez le milieu de l’étape 1A.
Remplacez le milieu usé par le milieu de stade 1A et incubez pendant 24 heures. Le lendemain, remplacez le milieu usé des puits par un milieu de stade 1B fraîchement préparé. À la deuxième étape, le premier jour, préparez le milieu de stade 2A et remplacez le milieu des puits par le milieu de stade 2A.
Incuber pendant 24 heures avant d’ajouter le milieu de stade 2B dans les puits ; Une troisième étape, le premier jour, aspire le milieu épuisé des puits, puis ajoute le milieu de l’étape 3 fraîchement préparé et incube dans un incubateur humidifié. À l’étape quatre, le premier jour, remplacez le milieu épuisé par un milieu de l’étape 4 fraîchement préparé et incubez dans un incubateur humidifié. À l’étape quatre, le cinquième jour, prétraitez les micropuits avec 500 microlitres de solution de rinçage anti-adhérence par puits.
Centrifugez la plaque du micropuits à 1 300 g pendant cinq minutes et observez-la au microscope pour vous assurer qu’aucune bulle d’air n’est piégée dans les micropuits. Ensuite, aspirez la solution de rinçage des puits et rincez une fois avec un millilitre de DPBS. Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu d’agrégation dans chaque puits.
Après avoir retiré le milieu épuisé des cultures de progéniteurs pancréatiques, laver la culture une fois avec du DPBS avant de se dissocier en cellules individuelles avec un réactif de dissociation à 37 degrés Celsius pendant 10 à 12 minutes. Rincez les cellules avec du DMEM/F12 chaud et transférez-les dans un tube pour centrifugation à 300 G pendant cinq minutes. Remettre la pastille en suspension dans le milieu d’agrégation et effectuer le comptage des cellules vivantes.
Ensemencer de 2,4 à 3,6 millions de cellules par puits et ajouter un milieu d’agrégation à chaque puits pour obtenir un volume final de deux millilitres par puits. À l’aide d’une pointe de pipette P-1000, pipetez doucement les cellules de haut en bas pour une répartition uniforme. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 G pendant cinq minutes pour capturer les cellules dans les micropuits et incuber dans un incubateur humidifié pendant 24 heures pour initier l’agrégation.
Après l’agrégation, pipetez doucement les agrégats de haut en bas plusieurs fois pour faire flotter les cellules non agrégées. Une fois que les agrégats se déposent, retirez avec précaution le milieu usé contenant des cellules flottantes non agrégées sans aspirer les agrégats. Verser un milieu frais de l’étape 5 sur la surface de la plaque de micropuits pour déloger les agrégats des micropuits et les transférer dans la plaque à six puits à très faible fixation.
Après avoir recueilli tous les agrégats dans les six puits à très faible fixation, les remettre en suspension dans le milieu de l’étape 5 pour ajuster la densité à 20 grappes par 100 microlitres. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanaux, versez 50 microlitres de milieu de l’étape 5 dans chaque puits d’une plaque ULA à fond plat à 96 puits à fixation ultra-faible. Remplissez les puits d’angle et de bord avec 200 microlitres de DPBS.
Mélangez délicatement la remise en suspension de la grappe à chaque fois avant de distribuer. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de la remise en suspension du cluster dans chaque puits de la plaque ULA à fond plat de 96 puits. Placez les plaques de culture sur une surface plane dans un incubateur humidifié pendant 24 heures.
Le lendemain ou à l’étape cinq, le deuxième jour, à l’aide d’une pipette multicanal, retirez délicatement 90 microlitres du milieu usé de chaque puits et rafraîchissez avec 100 microlitres de milieu de l’étape 5. À l’étape six, le premier jour, remplacez les 90 microlitres de milieu usé par 100 microlitres de milieu de l’étape 6 par puits. À l’étape sept, le premier jour, retirez le milieu épuisé et ajoutez 100 microlitres de milieu de l’étape 7 par puits.
Dans cette étude, à l’aide de plaques de micropuits, des milliers de clusters de progéniteurs pancréatiques de taille et de morphologie uniformes ont été générés à la fois, et l’efficacité moyenne d’agrégation était d’environ 74%Il est important de noter que l’expression de PDX1 et NKX6.1 a été maintenue à des niveaux élevés dans ces clusters après l’agrégation. Les cellules exprimant l’insuline ont été progressivement induites au sein des clusters endocriniens, comme l’indique l’augmentation des signaux GFP de l’insuline dans les cultures vivantes au fil du temps. La taille de l’amas passe d’un diamètre moyen de 150 microns à 220 microns entre les stades cinq et sept.
La caractérisation de la composition cellulaire montre que les îlots hPSC de stade sept générés par le protocole hybride étaient principalement endocriniens et comprenaient quatre principaux types de cellules d’îlots pancréatiques. Ce protocole hybride a généré en grande partie des cellules d’îlots pancréatiques monohormonales et une minorité de cellules bihormonales. Les cellules bêta en voie de différenciation expriment NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 et GLUT1.
De plus, 60 % d’insuline et de cellules doublement positives PDX1 et 50 % de cellules doublement positives du peptide C et NKX6.1 ont été induits dans les cultures de stade sept. In vitro, des tests statiques de sécrétion d’insuline stimulés par le glucose ont démontré que les îlots hPSC de stade sept sécrètent des niveaux élevés d’insuline en réponse à un taux élevé de glucose et à une dépolarisation directe. La teneur totale en insuline des îlots hPSC est environ la moitié de celle des îlots cadavériques.
Le système de culture statique à puits multiples pour la génération d’îlots dérivés de cellules souches facilite divers essais in situ et peut servir de plate-forme appropriée pour le développement de protocoles et les études de criblage à petite échelle. Pour minimiser la fusion de la grappe lors d’une culture statique dans une plaque à 96 puits, n’inclinez pas la plaque lors du changement de milieu. Gardez toujours la plaque horizontale sur une surface plane.
