Este protocolo utiliza una estrategia de cultivo en suspensión estática para diferenciar los progenitores pancreáticos en grupos de islotes, reduce el estrés que experimentan las células durante el cultivo por agitación y mejora en gran medida el éxito de la diferenciación. El protocolo de hardware es fácil de usar para principiantes y ahorra tiempo para la optimización de las primeras cuatro etapas. El personal con técnicas básicas de cultivo de células madre puede reproducir este protocolo con una buena probabilidad de generar grupos funcionales similares a islotes.
Para comenzar, recubra previamente los pocillos de cultivo con matrigel calificado hESC diluido en DMEM/F12 helado y coloque la placa en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Aspire el medio gastado del cultivo de hPSC y enjuague una vez con DPBS. Disocie el cultivo de hPSC en células individuales con una enzima de disociación celular a 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos.
Después de la disociación, enjuague las células agregando medio DMEM/F12 tibio y transfiéralas a un tubo cónico de 15 o 50 mililitros. Centrifugar la suspensión celular a 300 G durante cinco minutos y resuspender el gránulo en un medio completo de células madre que contenga 10 micromolares de Y-27632. Luego, realice el recuento de células vivas con un hemocitómetro.
Después de contar, aspire el matrigel diluido e inmediatamente siembre células vivas a 1,6 a 1,8 veces 10 a la densidad de cinco por centímetro cuadrado en pocillos recubiertos de matrigel. Incubar las células en una incubadora humidificada durante 24 horas. A continuación, en la primera etapa, el primer día, prepare la etapa 1A media.
Reemplace el medio gastado con medio de etapa 1A e incube durante 24 horas. Al día siguiente, reemplace el medio gastado de los pocillos con medio de etapa 1B recién preparado. En la etapa dos, el primer día, prepare el medio de la etapa 2A y reemplace el medio de los pozos con el medio de la etapa 2A.
Incubar durante 24 horas antes de agregar el medio de la etapa 2B en los pocillos; En la tercera etapa, el primer día, aspire el medio gastado de los pocillos, luego agregue el medio de la etapa 3 recién preparado e incube en una incubadora humidificada. En la etapa cuatro, el primer día, reemplace el medio gastado con medio de etapa 4 recién preparado e incube en una incubadora humidificada. En la etapa cuatro, el día cinco, pretrate los micropocillos con 500 microlitros de solución de enjuague antiadherente por pocillo.
Centrifugar la placa de micropocillos a 1.300 G durante cinco minutos y observar bajo un microscopio para asegurarse de que no haya burbujas de aire atrapadas en los micropocillos. A continuación, aspire la solución de enjuague de los pocillos y enjuague una vez con un mililitro de DPBS. Luego, agregue un mililitro de medio de agregación a cada pocillo.
Después de retirar el medio gastado de los cultivos de progenitores pancreáticos, lavar el cultivo una vez con DPBS antes de disociarlo en células individuales con un reactivo de disociación a 37 grados Celsius durante 10 a 12 minutos. Enjuague las células con DMEM/F12 tibio y transfiéralas a un tubo para centrifugarlas a 300 G durante cinco minutos. Vuelva a suspender el gránulo en el medio de agregación y realice el recuento de células vivas.
Siembre de 2,4 a 3,6 millones de células por pocillo y agregue un medio de agregación a cada pocillo para lograr un volumen final de dos mililitros por pocillo. Con una punta de pipeta P-1000, pipetee suavemente las células hacia arriba y hacia abajo para una distribución uniforme. Centrifugar la suspensión celular a 300 G durante cinco minutos para capturar las células en los micropocillos e incubar en una incubadora humidificada durante 24 horas para iniciar la agregación.
Después de la agregación, pipetee suavemente los agregados hacia arriba y hacia abajo varias veces para hacer flotar cualquier célula no agregada. Una vez que los agregados se asienten, retire con cuidado el medio gastado que contiene celdas flotantes no agregadas sin aspirar agregados. Dispense el medio fresco de la etapa 5 sobre la superficie de la placa de micropocillos para desalojar los agregados de los micropocillos y transfiéralos a la placa de seis pocillos de fijación ultrabaja.
Después de recolectar todos los agregados en los seis pozos de fijación ultra baja, vuelva a suspenderlos en el medio de la etapa 5 para ajustar la densidad a 20 racimos por cada 100 microlitros. A continuación, con una pipeta multicanal, dispense 50 microlitros de medio de fase 5 en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo plano ULA de fijación ultrabajo. Llene los pozos de las esquinas y los bordes con 200 microlitros de DPBS.
Mezcle suavemente la resuspensión del racimo cada vez antes de dispensar. Luego, agregue 100 microlitros de la resuspensión del racimo en cada pocillo de la placa de fondo plano ULA de 96 pocillos. Coloque las placas de cultivo sobre una superficie nivelada en una incubadora humidificada durante 24 horas.
Al día siguiente o en la etapa cinco, el día dos, con una pipeta multicanal, retire suavemente 90 microlitros del medio gastado de cada pocillo y refresque con 100 microlitros del medio de la etapa 5. En la etapa seis, el primer día, reemplace los 90 microlitros de medio gastado con 100 microlitros de medio de la etapa 6 por pocillo. En la etapa siete, el primer día, retire el medio gastado y agregue 100 microlitros de medio de la etapa 7 por pocillo.
En este estudio, utilizando placas de micropocillos, se generaron miles de grupos de progenitores pancreáticos con tamaño y morfología uniformes a la vez, y la eficiencia de agregación promedio fue de alrededor del 74%. Las células que expresan insulina se indujeron gradualmente dentro de los grupos endocrinos, como lo indica el aumento de las señales de GFP de insulina en cultivos vivos a lo largo del tiempo. El tamaño del racimo aumenta de un diámetro promedio de 150 micras a 220 micras entre las etapas cinco y siete.
La caracterización de la composición celular muestra que los islotes de hPSC en etapa siete generados por el protocolo híbrido eran principalmente endocrinos y estaban compuestos por cuatro tipos principales de células de islotes. Este protocolo híbrido generó en gran medida células de islotes monohormonales y una minoría de células bihormonales. Las células beta diferenciadoras expresan NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 y GLUT1.
Además, se indujo un 60% de insulina y células doble positivas PDX1 y un 50% de células doble positivas de péptido C y NKX6.1 en cultivos de estadio siete. In vitro, los ensayos de secreción de insulina estimulados por glucosa estática demostraron que los islotes de hPSC en estadio siete secretan niveles altos de insulina en respuesta a la glucosa alta y la despolarización directa. El contenido total de insulina de los islotes hPSC es aproximadamente la mitad de la cantidad de islotes cadavéricos.
El sistema de cultivo estático basado en múltiples pocillos para generar islotes derivados de células madre facilita varios ensayos in situ y puede servir como una plataforma adecuada para el desarrollo de protocolos y estudios de detección a pequeña escala. Para minimizar la fusión del racimo durante un cultivo estático en una placa de 96 pocillos, no incline la placa al realizar el cambio de medio. Mantenga siempre la placa horizontal sobre una superficie nivelada.
