이 프로토콜은 췌장 전구세포를 섬 클러스터로 분화하기 위한 정적 현탁 배양 전략을 사용하고, 진탕 배양 중에 세포가 경험하는 스트레스를 줄이고, 분화 성공을 크게 향상시킵니다. 하드웨어 프로토콜은 초보자에게 친숙하며 처음 4단계의 최적화를 위한 시간을 절약합니다. 기본적인 줄기 세포 배양 기술을 가진 사람은 기능적인 섬과 같은 클러스터를 생성할 수 있는 좋은 기회로 이 프로토콜을 재현할 수 있습니다.
먼저 얼음처럼 차가운 DMEM/F12에 희석한 hESC 인증 마트리겔로 배양제를 사전 코팅하고 플레이트를 가습된 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다. hPSC 배양액에서 사용한 배지를 흡인하고 DPBS로 한 번 헹굽니다. hPSC 배양액을 섭씨 37도에서 3-5분 동안 세포 해리 효소를 사용하여 단일 세포로 해리시킵니다.
해리 후 따뜻한 DMEM/F12 배지를 추가하여 세포를 헹구고 15밀리리터 또는 50밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 세포 현탁액을 300G에서 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 10마이크로몰 Y-27632를 함유하는 줄기세포 완전 배지에 재현탁시킵니다. 그런 다음 혈구계를 사용하여 살아있는 세포 계수를 수행합니다.
흡입 후 희석된 마트리겔을 계산하고 즉시 살아있는 세포를 1.6 내지 1.8배의 10 내지 5제곱센티미터 밀도로 마트리겔 코팅된 웰에 파종합니다. 가습 인큐베이터에서 24시간 동안 세포를 배양합니다. 다음으로, 1 단계, 첫째 날, 1 단계 1A 매체를 준비합니다.
사용한 배지를 스테이지 1A 배지로 교체하고 24시간 동안 배양합니다. 다음날 우물에서 사용한 배지를 새로 준비한 스테이지 1B 배지로 교체합니다. 2단계, 첫째 날에는 2A 단계 배지를 준비하고 웰의 배지를 2A 단계 배지로 교체합니다.
2B 단계 배지를 웰에 추가하기 전에 24 시간 동안 배양하십시오. 3단계, 첫째 날, 우물에서 사용한 배지를 흡인한 다음 갓 준비한 3단계 배지를 추가하고 가습 인큐베이터에서 배양합니다. 첫째 날인 4단계에서는 사용한 배지를 새로 준비한 4단계 배지로 교체하고 가습 인큐베이터에서 배양합니다. 4단계, 5일차에는 웰당 500마이크로리터의 접착 방지 헹굼 용액으로 마이크로웰을 전처리합니다.
마이크로웰 플레이트를 1, 300G에서 5분 동안 원심분리하고 현미경으로 관찰하여 기포가 마이크로웰에 갇히지 않도록 합니다. 그런 다음 우물에서 헹굼 용액을 흡인하고 DPBS 1밀리리터로 한 번 헹굽니다. 그런 다음 각 웰에 1밀리리터의 응집 매체를 추가합니다.
췌장 전구 배양물에서 사용한 배지를 제거한 후, 섭씨 37도에서 10-12분 동안 해리 시약을 사용하여 단일 세포로 해리하기 전에 DPBS로 배양물을 한 번 세척합니다. 따뜻한 DMEM/F12로 세포를 헹구고 300G에서 5분 동안 원심분리를 위해 튜브에 옮깁니다. 펠릿을 응집 배지에 재현탁시키고 살아있는 세포 계수를 수행합니다.
웰당 2.4 - 360만 개의 세포를 파종하고 각 웰에 응집 배지를 추가하여 웰당 2밀리리터의 최종 부피를 얻습니다. P-1000 피펫 팁을 사용하여 세포가 고르게 분포되도록 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 세포 현탁액을 300G에서 5분 동안 원심분리하여 마이크로웰의 세포를 포획하고 가습 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하여 응집을 시작합니다.
응집 후 응집체를 위아래로 여러 번 부드럽게 피펫팅하여 응집되지 않은 세포를 띄웁니다. 응집체가 가라앉으면 흡인 응집체 없이 부유하는 응집되지 않은 세포가 들어 있는 사용된 배지를 조심스럽게 제거합니다. 새로운 스테이지 5 배지를 마이크로웰 플레이트 표면에 분사하여 마이크로웰에서 응집체를 제거하고 초저 부착 6웰 플레이트로 옮깁니다.
초저 부착 6개의 웰에서 모든 골재를 수집한 후 5단계 배지에 다시 현탁시켜 밀도를 100마이크로리터당 20개의 클러스터로 조정합니다. 그런 다음 멀티채널 피펫을 사용하여 50마이크로리터의 스테이지 5 배지를 초저 부착 ULA 플랫 바닥 96웰 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 모서리 및 가장자리 웰을 200마이크로리터의 DPBS로 채웁니다.
분배하기 전에 매번 클러스터 재현탁액을 부드럽게 혼합하십시오. 그런 다음 100마이크로리터의 클러스터 재현탁액을 ULA 평평한 바닥 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 배양 플레이트를 가습 인큐베이터의 평평한 표면에 24시간 동안 놓습니다.
다음날 또는 5단계, 2일차에 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 사용된 배지 90마이크로리터를 부드럽게 제거하고 5단계 배지 100마이크로리터로 리프레시합니다. 6단계, 첫째 날에는 우물당 90마이크로리터의 사용한 배지를 100마이크로리터의 6단계 배지로 교체합니다. 7단계, 첫째 날, 사용한 배지를 제거하고 웰당 100마이크로리터의 7단계 배지를 추가합니다.
본 연구에서는 마이크로웰 플레이트를 이용하여 크기와 형태가 균일한 수천 개의 췌장 전구 군집을 한 번에 생성하였고, 평균 응집 효율은 약 74%였으며, 중요한 것은 이들 군집에서 PDX1 및 NKX6.1의 발현이 응집 후 높은 수준으로 유지되었다는 점이다. 인슐린 발현 세포는 시간이 지남에 따라 살아있는 배양에서 인슐린 GFP 신호가 증가한 것으로 표시된 바와 같이 내분비 클러스터 내에서 점차적으로 유도되었습니다. 클러스터 크기는 5단계와 7단계 사이에 평균 직경 150미크론에서 220미크론으로 증가합니다.
세포 조성의 특성 분석은 하이브리드 프로토콜에 의해 생성된 7기 hPSC 섬이 주로 내분비이며 4개의 주요 섬 세포 유형으로 구성되어 있음을 보여줍니다. 이 하이브리드 프로토콜은 주로 단일 호르몬 섬 세포와 소수의 이중 호르몬 세포를 생성했습니다. 분화 베타 세포는 NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 및 GLUT1을 발현합니다.
또한, 7단계 배양에서 60%의 인슐린 및 PDX1 이중 양성 세포와 50%의 C-펩타이드 및 NKX6.1 이중 양성 세포를 유도했습니다. 시험관 내에서 정적 포도당 자극 인슐린 분비 분석은 7기 hPSC 섬이 높은 포도당 및 직접적인 탈분극에 반응하여 높은 인슐린 수치를 분비한다는 것을 입증했습니다. hPSC 섬의 총 인슐린 함량은 사체 섬의 약 절반입니다.
줄기 세포 유래 섬을 생성하기 위한 다중 웰 기반 정적 배양 시스템은 다양한 in situ 분석을 용이하게 하며 프로토콜 개발 및 소규모 스크리닝 연구에 적합한 플랫폼 역할을 할 수 있습니다. 96웰 플레이트에서 정적 배양 중에 클러스터 융합을 최소화하려면 배지 교환을 수행할 때 플레이트를 기울이지 마십시오. 플레이트는 항상 평평한 표면에서 수평을 유지하십시오.
