Questo protocollo utilizza una strategia di coltura in sospensione statica per differenziare i progenitori pancreatici in cluster di isole, riduce le sollecitazioni che le cellule subiscono durante la coltura di agitazione e migliora notevolmente il successo della differenziazione. Il protocollo hardware è adatto ai principianti e consente di risparmiare tempo per l'ottimizzazione delle prime quattro fasi. Il personale con tecniche di coltura di cellule staminali di base può riprodurre questo protocollo con una buona possibilità di generare cluster funzionali simili a isole.
Per iniziare, prerivestire i pozzetti di coltura con matrigel qualificato hESC diluito in DMEM/F12 ghiacciato e posizionare la piastra in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Aspirare il terreno esausto dalla coltura hPSC e risciacquare una volta con DPBS. Dissociare la coltura di hPSC in singole cellule con enzima di dissociazione cellulare a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti.
Dopo la dissociazione, sciacquare le cellule aggiungendo terreno caldo DMEM/F12 e trasferirle in una provetta conica da 15 o 50 millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 G per cinque minuti e risospendere il pellet in un terreno completo di cellule staminali contenente 10 micromolari Y-27632. Quindi, eseguire il conteggio delle cellule vive utilizzando un emocitometro.
Dopo aver contato, aspirare matrigel diluito e seminare immediatamente cellule vive a 1,6-1,8 volte da 10 a cinque per centimetro quadrato di densità su pozzetti rivestiti di matrigel. Incubare le cellule in un'incubatrice umidificata per 24 ore. Successivamente, nella fase uno, il primo giorno, prepara la fase 1A media.
Sostituire il terreno esausto con terreno di stadio 1A e incubare per 24 ore. Il giorno successivo, sostituire il terreno esausto dai pozzetti con un terreno di fase 1B appena preparato. Nella fase due, il primo giorno, preparare il terreno di fase 2A e sostituire il terreno dai pozzetti con il terreno di fase 2A.
Incubare per 24 ore prima di aggiungere il terreno di fase 2B nei pozzetti; Nella fase tre, il primo giorno, aspirare il terreno esausto dai pozzetti, quindi aggiungere il terreno di fase 3 appena preparato e incubare in un'incubatrice umidificata. Nella fase quattro, il primo giorno, sostituire il terreno esausto con terreno di fase 4 appena preparato e incubare in un'incubatrice umidificata. Nella fase quattro, il quinto giorno, pretrattare i micropozzetti con 500 microlitri di soluzione di risciacquo antiaderenza per pozzetto.
Centrifugare la piastra per micropozzetti a 1.300 g per cinque minuti e osservare al microscopio per assicurarsi che nessuna bolla d'aria rimanga intrappolata nei micropozzetti. Successivamente, aspirare la soluzione di risciacquo dai pozzetti e risciacquare una volta con un millilitro di DPBS. Quindi, aggiungere un millilitro di terreno di aggregazione a ciascun pozzetto.
Dopo aver rimosso il terreno esausto dalle colture del progenitore pancreatico, lavare la coltura una volta con DPBS prima di dissociarsi in singole cellule con reagente di dissociazione a 37 gradi Celsius per 10-12 minuti. Sciacquare le cellule con DMEM/F12 tiepido e trasferirle in una provetta per centrifugazione a 300 G per cinque minuti. Risospendere il pellet nel mezzo di aggregazione ed eseguire il conteggio delle cellule vive.
Seminare da 2,4 a 3,6 milioni di cellule per pozzetto e aggiungere un terreno di aggregazione a ciascun pozzetto per ottenere un volume finale di due millilitri per pozzetto. Utilizzando un puntale per pipette P-1000, pipettare delicatamente le cellule verso l'alto e verso il basso per una distribuzione uniforme. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 G per cinque minuti per catturare le cellule nei micropozzetti e incubare in un incubatore umidificato per 24 ore per avviare l'aggregazione.
Dopo l'aggregazione, pipettare delicatamente gli aggregati su e giù più volte per far galleggiare le cellule non aggregate. Una volta che gli aggregati si sono depositati, rimuovere con cautela il mezzo esausto contenente celle galleggianti non aggregate senza aspirare gli aggregati. Erogare il terreno fresco di fase 5 sulla superficie della piastra a micropozzetti per rimuovere gli aggregati dai micropozzetti e trasferirli nella piastra a sei pozzetti a bassissimo attacco.
Dopo aver raccolto tutti gli aggregati nei sei pozzetti a bassissimo attacco, risospenderli nel terreno di fase 5 per regolare la densità a 20 cluster per 100 microlitri. Quindi, utilizzando una pipetta multicanale, erogare 50 microlitri di terreno di fase 5 in ciascun pozzetto di una piastra ULA a fondo piatto a 96 pozzetti con attacco ultrabasso. Riempire i pozzetti angolari e perimetrali con 200 microlitri di DPBS.
Miscelare delicatamente la risospensione del grappolo ogni volta prima dell'erogazione. Quindi, aggiungere 100 microlitri della risospensione del cluster in ciascun pozzetto della piastra a fondo piatto a 96 pozzetti ULA. Posizionare le piastre di coltura su una superficie piana in un'incubatrice umidificata per 24 ore.
Il giorno successivo o nella fase cinque, il secondo giorno, utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere delicatamente 90 microlitri del terreno esausto da ciascun pozzetto e rinfrescare con 100 microlitri di terreno di fase 5. Nella fase sei, il primo giorno, sostituire i 90 microlitri di terreno esausto con 100 microlitri di terreno di fase 6 per pozzetto. Nella fase sette, il primo giorno, rimuovere il terreno esausto e aggiungere 100 microlitri di terreno di fase 7 per pozzetto.
In questo studio, utilizzando piastre a micropozzetti, sono stati generati migliaia di cluster di progenitori pancreatici con dimensioni e morfologia uniformi alla volta e l'efficienza media di aggregazione è stata di circa il 74%È importante sottolineare che l'espressione di PDX1 e NKX6.1 è stata mantenuta a livelli elevati in questi cluster dopo l'aggregazione. Le cellule che esprimono l'insulina sono state gradualmente indotte all'interno dei cluster endocrini, come indicato dall'aumento dei segnali di insulina GFP nelle colture viventi nel tempo. La dimensione del grappolo aumenta da un diametro medio di 150 micron a 220 micron tra le fasi cinque e sette.
La caratterizzazione della composizione cellulare mostra che le isole hPSC di stadio sette generate dal protocollo ibrido erano principalmente endocrine e comprendevano quattro principali tipi di cellule insulari. Questo protocollo ibrido ha generato in gran parte cellule insulari monoormonali e una minoranza di cellule biormonali. Le cellule beta differenzianti esprimono NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 e GLUT1.
Inoltre, il 60% di insulina e PDX1 di cellule doppiamente positive e il 50% di cellule di peptide C e NKX6.1 di cellule doppie positive sono state indotte nelle colture di stadio sette. In vitro, i saggi statici di secrezione di insulina stimolata dal glucosio hanno dimostrato che le isole hPSC di stadio sette secernono alti livelli di insulina in risposta all'alto livello di glucosio e alla depolarizzazione diretta. Il contenuto totale di insulina delle isole hPSC è circa la metà della quantità di isole cadaveriche.
Il sistema di coltura statica a più pozzetti per la generazione di isole derivate da cellule staminali facilita vari saggi in situ e può fungere da piattaforma adatta per lo sviluppo di protocolli e studi di screening su piccola scala. Per ridurre al minimo la fusione a grappolo durante una coltura statica in una piastra a 96 pozzetti, non inclinare la piastra durante il cambio del terreno. Tenere sempre la piastra orizzontale su una superficie piana.
