具有eGFP组成型表达的 利什曼原虫 菌株的发展

该协议是生成可用于高通量筛选测定以评估分子潜力和传统活性的菌株的关键 展示该程序的将是我实验室的研究助理Juana Quintero和Laura Pineda。首先，使用高保真聚合酶扩增靶基因以保留编码序列。将引物以0.2微摩尔的终浓度添加到反应混合物中，并按照手稿中所述运行PCR循环方案。

使用常规PCR产物纯化试剂盒纯化扩增的PCR片段。要修剪eGFP PCR产物的末端，请根据制造商的说明与Kpn I酶进行反应，并在37摄氏度下孵育一小时。然后在反应中加入100毫摩尔氯化钠和10单位Bgl II，孵育15分钟。

消化后，如前所示纯化反应。接下来，按照前面所示的顺序酶切，用Bgl II和Kpl I消化pLEXSY表达载体。在含有连接酶缓冲液和三个单位 T4 DNA 连接酶的 20 μL 反应中连接 100 纳克消化的 pLEXSY 载体和 28 纳克消化的 eGFP。

在四摄氏度下孵育过夜。在孵育结束时，使用标准转化方案用连接产物转化感受态大肠杆菌细胞。将转化的细胞接种在LB氨苄青霉素琼脂中，并在30摄氏度下孵育24小时以选择重组克隆。

筛选菌落后，从阳性克隆中纯化质粒DNA，以便使用商业质粒分离试剂盒进行后续转染。为了产生质粒的线性化片段，取至少10微克纯化的pLEXSY eGFP质粒，并在25摄氏度下用SWA1消化三到四个小时。在孵育结束时，在65摄氏度下加热消化产物20分钟。

然后在琼脂糖凝胶电泳中运行消化产物以分离所得片段。根据制造商的说明，使用商业琼脂糖凝胶提取试剂盒纯化表达盒。培养寄生虫培养物，直到有足够的对数期或早期固定期前鞭毛体。

如果需要，合并多个培养瓶的内容物。在室温下以2， 000G离心寄生虫培养物三分钟。将沉淀重悬于4摄氏度的电穿孔缓冲液中，以获得每毫升10至8个寄生虫的浓度，并将其放在冰上10分钟。

同时，在 pH 8.0 的 50 微升水或 10 毫摩尔三缓冲液和直径为 2 毫米的电穿孔比色皿中构建具有 2 至 10 微克线性化 pLEXSY eGFP 的预冷管。接下来，将350微升预冷的寄生虫加入带有线性质粒的管中，并将整个400微升转移到冰上的电穿孔比色皿中。用质粒电穿孔寄生细胞，同时用没有质粒DNA的寄生虫细胞作为阴性对照。

将比色皿放在冰上 10 分钟。将电穿孔寄生虫转移到5毫升适当的培养基中，并在26摄氏度下孵育20小时。电穿孔后约20小时，在显微镜下观察培养物，并根据所使用的pLEXSY质粒添加适当的选择性抗生素。

显微镜下跟踪培养物，直到有和没有质粒DNA电穿孔的寄生虫有明显差异。为了通过流式细胞术验证寄生虫荧光，在室温下以2， 000G离心一毫升固定相培养物三分钟。在PBS中洗涤细胞两次后，将最终沉淀重悬于一毫升PBS中。

运行样本并以每秒 0.5 微升的速度收集 20， 000 个事件。将前向散射、侧向散射和荧光一通道的增益值分别设置为 225.0、200.0 和 520.0。创建一个包含寄生虫种群的门 G1。

通过该门过滤FL1通道以确定前鞭毛体的自发荧光，并为FL1通道设置范围门G2。运行转染的寄生虫以验证是否有荧光。记录G1中荧光寄生虫的百分比和G2中荧光强度的平均值。通过常规苯酚氯仿提取或商业试剂盒从两到五毫升固定相寄生虫培养物中纯化基因组DNA。

使用手稿中所述的循环方案对pLEXSY-sat2.1进行诊断PCR。通过流式细胞术确认荧光后，制备浓度为每毫升五个前鞭毛的重组寄生虫稀释液。将100微升稀释液加入96孔板的每个孔中，并使板不受干扰至少12小时。

以最小100X的放大倍率显微镜跟踪板，直到检测到寄生虫生长的孔。当井中充满寄生虫时，使用内容物接种五毫升培养物。一旦克隆接种的培养物到达固定相，如前所述使用流式细胞术验证荧光。

选择具有98%至99%荧光寄生虫和最高平均荧光强度的克隆进行体外和体内测定。用pLEXSY eGFP构建体转化的大肠杆菌细胞的集落PCR产生了859碱基对产物。使用SWA1对质粒进行全酶切得到两个片段，一个2.9千碱基对片段，其中包含在大肠杆菌中复制和选择所需的所有元件，另一个7至8千碱基对片段代表用于转染的线性表达盒。

流式细胞术分析显示，82%的转染的帕纳梅斯乳杆菌寄生虫表达eGFP。多克隆选择后，流式细胞术分析的多诺瓦尼乳杆菌寄生虫中有98.44%是荧光的，而帕纳梅氏乳杆菌的荧光率为82.0%。pLEXSY eGFP成功整合到SSU基因座中，在诊断PCR中产生了2.3千碱基对产物。

选择具有最高荧光寄生虫百分比和平均荧光强度的克隆进一步用于药物筛选测定。该方法允许用