BS3 化学交联测定:评估慢性应激对啮齿动物大脑中细胞表面 GABA_A 受体呈递的影响

使用BS3作为交联剂的化学交联测定将有助于确定神经递质受体细胞表面水平，这是神经传递功效的关键决定因素。该测定对于响应动物模型中各种精神药物或心因性应激模式的受体动力学的大脑区域特异性评估特别有用。首先，迅速从安乐死的C57BL / 6J小鼠的头骨中取出大脑。

将其浸入含有冰冷PBS的培养皿中10至15秒。将冷却的大脑放入冰上的大脑基质中，面向腹侧朝上。要切开大脑冠状，请将第一把剃须刀片插入嗅球和嗅蒂之间的边界。

使用三到四个额外的剃须刀片，以一毫米的间隔连续切割大脑的前部冠状。将插入的剃须刀片放在一起，将冠状切片从脑基质上抬起，留下后部。使用镊子将剃须刀片彼此分开，并将它们放在平坦、冷却的表面上，脑切片朝上。

要对前额叶皮层进行采样，请选择包含嗅蒂的第一个切片后面的第二和第三切片。使用组织打孔器或镊子，去除所需区域。将纸巾放在冷却的剃须刀片上，均匀地分成两块。

使用镊子的细尖在剃须刀片上以多个垂直运动将每个组织切成碎片。用30微升BS3溶液或载体溶液E加标含有人工脑脊液的预冷标记管，然后立即将切碎的组织转移到所需的管中。要对海马体进行采样，请从基质中取出大脑的后部，并将其放在冷却平坦表面上的湿滤纸上，背侧朝上。

用弯曲的探针和镊子从背侧接近，从两个半球解剖海马体，然后将组织切碎并将其转移到适当的尖刺管中，如前所述。对于交联反应，将装有组织和溶液的管倒置，将组织块破碎成小块。将样品在4摄氏度的试管旋转器上孵育30分钟至2小时，并记录每个试管的BS3孵育开始时间。

然后用78微升一摩尔甘氨酸淬灭反应。在4摄氏度下以恒定旋转进一步孵育10分钟，并记录淬火的开始和结束时间。在BS3交联后的蛋白质印迹分析中，非交联蛋白显示GABA-A受体的α5亚基总量约为55千道尔顿。

然而，BS3交联蛋白显示GABA-A受体的内膜相关α5亚基以约55千道尔顿迁移，以及代表与GABA-A受体的α5亚基共价交联的蛋白质复合物的较高分子量蛋白质物种。此外，与无应激对照小鼠相比，在UCMS的三周和五周时，在前额叶皮层中观察到GABA-A受体的表面α5亚基水平显着且逐渐降低。已知受体在环境温度下在质膜表面和内膜之间穿梭。

因此，在低温下进行组织解剖很重要。通过利用交联测定，揭示了心理社会压力可以显着调节GABA受体的表面水平，这部分是焦虑，行为或认知缺陷的分子基础。