单动物、单管 RNA 提取，通过 qRT-PCR 比较缓步动物 Hypsibius 示例中的相对转录水平

我们专注于揭示极端耐受缓步动物 Hypsibius exemplaris 中神经弹性的分子机制。我们研究暴露于极端环境后的神经系统变化。我们发现缓步动物在经历极端环境后神经解剖结构和运动功能发生了大规模变化。

使用缓步动物作为分子生物学研究的模式生物是相对较新的。因此，有许多技术尚未针对它们在缓步动物中的应用进行完全优化。尽管我们在转录组学、蛋白质组学和转基因方面取得了长足的进步，但仍需要一些方法和工具来验证和功能评估仍然未开发的靶蛋白。

当前从单个缓步动物中提取 RNA 的方案尚未应用于 qPCR 或需要多只动物进行提取。为了继续我们在缓步动物的分子神经生物学方面的工作，我们需要一种方法来提取和量化来自个体动物的 RNA，首先，确认 RNA 测序结果，其次，评估单独注射动物的 RNAi 效率，以及第三，探索不同种群转录变化的个体差异。我们的方法在三个方面改进了以前的技术。

与以前的单缓步动物提取方法相比，它将提取时间缩短了约 30%。我们的方法还将提取成本降低了 100 倍以上，因为它绕过了线性 PCR 扩增步骤的需要。最后，我们的方法比以前的方法效率高 200 倍，因为它绕过了纯化的需要，这通常会导致 RNA 的大量损失。

我们的研究结果将使缓步动物研究人员能够通过 qRT-PCR 以低成本和有效的方式量化来自单个缓步动物的相对转录水平。我们看到这被用于以高度定量的方式量化 RNAi 敲低的效率，确认测序命中，并探索各种动物之间转录反应的个体差异。首先，以较低的设置点燃本生灯或其他受控火焰源。

每只手各拿一端握住玻璃微量移液器，将其中心放在火焰上，直到玻璃开始融化。软化后，迅速将两端拉开，形成两个尖锐的尖端。然后，使用一对无菌细镊子轻轻折断微量移液器的尖端以调整其锋利度。

将玻璃微量移液器固定在微量移液器拉拔器上，避免接触加热丝。作为优化的起点，使用 182.2 克的拉力，通过一个拉动步骤将极坐标设置为 182.2 摄氏度。让细丝加热，使玻璃微量移液器因重力而分离成两个具有尖锐尖端的微量移液器。

将拉出的玻璃微量移液器存放在封闭的 100 毫米培养皿中，并用蜡或粘土固定，以防止锋利的尖端断裂。首先，获得所需尺寸的拉动玻璃微量移液器。然后制备互补的 DNA 合成预混液和缓步动物裂解缓冲液。

分装足够的裂解缓冲液，用于萃取，每只缓步动物使用 2 μL。向裂解缓冲液中加入核糖核酸酶抑制剂，使终浓度达到 4 单位/μL。将溶液短暂涡旋，然后在台式离心机中以 2000 g 的离心机在室温下旋转 5 秒钟。

将溶液储存在冰上。使用无菌过滤喷嘴的 P1000 移液器，从培养物中去除所需数量的缓步动物，并将它们放入无菌的 35 毫米培养皿中。用 1 毫升高压灭菌的无菌泉水清洗缓步动物 3 次，以去除藻类污染物。

将培养皿置于放大倍数为 25 倍至 50 倍的解剖显微镜下，并使用带滤光片的 P10 移液器将单个缓步动物转移到新的无菌 35 毫米培养皿中。现在，使用无菌过滤喷嘴的 P200 移液器在 100 μL 无菌无核酸酶水中洗涤单个缓步动物。将洗涤后的缓步动物转移到干净的无菌 PCR 管中，加入 1 至 2 μL 无菌无核酸酶水中。

在解剖显微镜下以 25 倍放大倍率观察缓步动物。为了便于去除水分，将拉出的玻璃微量移液器的尖端轻轻地折断管管外。使用玻璃微量移液器的毛细管作用去除水，直到缓步动物被一个小水泡包围。

向试管中加入 2 μL 缓步动物裂解缓冲液。涡旋后，在室温下以 2000 g 的离心力短暂离心试管 5 秒钟，并将样品储存在冰上。然后将含有缓步动物的样品放入 PCR 管架中并紧紧固定。

用长而粗的镊子夹住试管架，将其轻轻浸入液氮中，直到样品完全冷冻。接下来，从液氮中取出架子并将其放在冰上。解冻样品，每 15 秒监测一次，直到它变得明显透明。

重复冻融过程 5 次后，将样品置于冰上。将 2 μL 互补 DNA 合成预混液添加到含有缓步石裂解物的 PCR 管中。短暂弹动试管，在室温下以 2000 g 离心 5 秒，然后将样品置于冰上。

现在，将样品加载到热循环仪中并启动 cDNA 合成程序。合成完成后，立即将试管置于冰上。用 21 μL 无菌无核酸酶水将样品稀释至总体积为 25 μL。

与没有冻融循环的方案相比，优化后的方案使互补 DNA 产量提高了 3 倍，其中 6 个循环是最佳选择。当存在残留水时，RNA 提取不成功，这表明迫切需要去除多余的水以实现一致的裂解。RNA 产量约为 14.24 ng/缓步动物。

该方案在肌动蛋白转录物产量方面比 RNA 提取试剂盒效率高 200 倍以上，显著降低的 Ct 值和稳健的凝胶条带扩增证明了这一点。