نحن نركز على الكشف عن الآليات الجزيئية للمرونة العصبية في النموذج النموذجي بطيئات المشية شديد التحمل بطيئات المشية. ندرس تغيرات الجهاز العصبي بعد التعرض للبيئات القاسية. لقد اكتشفنا تغييرات واسعة النطاق في الهياكل التشريحية العصبية والوظيفة الحركية في بطيئات المشية بعد أن عانوا من بيئات قاسية.
يعد استخدام بطيئات المشية ككائن حي نموذجي للبحث البيولوجي الجزيئي أمرا جديدا نسبيا. على هذا النحو ، هناك العديد من التقنيات التي لم يتم تحسينها بالكامل بعد لتطبيقها في بطيئات المشية. على الرغم من أننا قطعنا خطوات ملحوظة في علم النسخ والبروتينات والتحول ، إلا أنه لا تزال هناك طرق وأدوات مطلوبة للتحقق والتقييم الوظيفي للبروتينات المستهدفة التي لا تزال متخلفة.
لم يتم تطبيق البروتوكولات الحالية لاستخراج الحمض النووي الريبي من بطيئات المشية المفردة على qPCR أو تتطلب متعددة للاستخراج. لمواصلة عملنا على البيولوجيا العصبية الجزيئية للبطيئات المشية ، احتجنا إلى طريقة لاستخراج وقياس الحمض النووي الريبي المشتق من الفردية أولا ، لتأكيد نتائج تسلسل الحمض النووي الريبي ، وثانيا ، تقييم كفاءة الحمض النووي الريبي في المحقونة بشكل فردي ، وثالثا ، استكشاف الفروق الفردية في تغييرات النسخ عبر السكان. تعمل طريقتنا على تحسين التقنيات السابقة بثلاث طرق.
يقلل من وقت الاستخراج بنسبة 30٪ تقريبا مقارنة بطرق الاستخراج الفردية السابقة. تقلل طريقتنا أيضا من تكلفة عمليات الاستخراج بأكثر من 100 ضعف لأنها تتجاوز الحاجة إلى خطوة تضخيم PCR الخطية. أخيرا ، طريقتنا أكثر كفاءة بمقدار 200 مرة من الطرق السابقة لأنها تتجاوز الحاجة إلى التنقية ، مما يؤدي غالبا إلى فقدان كبير للحمض النووي الريبي.
ستسمح النتائج التي توصلنا إليها للباحثين بالمشية بتحديد مستويات النسخ النسبية عبر qRT-PCR من بطيئات المشية الفردية بطريقة منخفضة التكلفة وفعالة. نرى أن هذا يستخدم لتحديد كفاءة ضربة قاضية من RNAi بطريقة كمية للغاية ، وتأكيد ضربات التسلسل ، واستكشاف الاختلافات الفردية في استجابة النسخ عبر المختلفة. للبدء ، أشعل موقد بنسن أو مصدر لهب آخر يتم التحكم فيه في إعداد منخفض.
أمسك ماصة زجاجية بطرف واحد في كل يد وضع مركزها فوق اللهب حتى يبدأ الزجاج في الذوبان. بمجرد التليين ، اسحب الطرفين بسرعة لإنشاء طرفين حادين. بعد ذلك ، باستخدام زوج من الملقط الدقيق المعقم ، قم بكسر طرف الماصة الدقيقة برفق لضبط حدتها.
قم بتأمين ماصة زجاجية دقيقة على مجتذب ماصة دقيقة، وتجنب ملامسة خيوط التسخين. كنقطة انطلاق للتحسين ، اضبط القطب على 78 درجة مئوية بخطوة سحب واحدة باستخدام وزن سحب يبلغ 182.2 جراما. دع الفتيل يسخن ، مما يتسبب في انفصال الماصة الدقيقة الزجاجية إلى ماصتين صغيرتين بنقاط حادة بسبب الجاذبية.
قم بتخزين الماصات الدقيقة الزجاجية المسحوبة في طبق بتري مغلق مقاس 100 ملم وثبتها بالشمع أو الطين لمنع الأطراف الحادة من الانكسار. للبدء ، احصل على الماصات الدقيقة الزجاجية المسحوبة ذات الأبعاد المرغوبة. ثم قم بإعداد تخليق الحمض النووي التكميلي Master Mix ومخزن تحلل بطيئات المشية.
Aliquot كمية كافية من المخزن المؤقت للتحلل للاستخراج باستخدام اثنين من ميكرولتر لكل بطيئات المشية. أضف مثبط الريبونوكلياز إلى المخزن المؤقت للتحلل لتحقيق تركيز نهائي يبلغ أربع وحدات لكل ميكرولتر. قم بتدوير المحلول لفترة وجيزة ، ثم قم بتدويره في جهاز طرد مركزي منضدي على حرارة 2000 جرام لمدة خمس ثوان في درجة حرارة الغرفة.
قم بتخزين المحلول على الثلج. باستخدام ماصة P1000 ذات مرشح معقم ، قم بإزالة العدد المطلوب من بطيئات المشية من المزرعة وضعها في طبق بتري معقم مقاس 35 ملم. اغسل المشية ثلاث مرات بمليلتر واحد من مياه الينابيع المعقمة المعقمة لإزالة ملوثات الطحالب.
ضع الطبق تحت مجهر تشريح بتكبير 25X إلى 50X واستخدم ماصة P10 ذات مائلة مرشح لنقل بطيئات مشية واحدة إلى طبق بتري معقم جديد مقاس 35 ملم. الآن ، باستخدام ماصة P200 معقمة ذات مائلة مرشح معقم ، اغسل بطيئات المشية المفردة في 100 ميكرولتر من الماء المعقم الخالي من النوكلياز. انقل المشية المغسولة إلى أنبوب PCR معقم نظيف في لتر إلى ميكرولتر من الماء المعقم الخالي من النوكلياز.
تصور بطيئات المشية تحت مجهر تشريح بتكبير 25 ضعفا. لتسهيل إزالة الماء ، قم بكسر طرف الماصة الدقيقة الزجاجية المسحوبة برفق خارج الأنبوب. باستخدام الحركة الشعرية للماصة الدقيقة الزجاجية ، قم بإزالة الماء حتى يحيط ببطيئات المشية بفقاعة صغيرة من الماء.
أضف ميكرولترين من محلول تحلل بطيئات المشية إلى الأنبوب. بعد الدوامة لفترة وجيزة ، قم بالطرد المركزي للأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس ثوان عند 2000 جرام وقم بتخزين العينة على الجليد. ثم ضع العينة التي تحتوي على بطيئات المشية في رف أنبوب PCR وثبتها بإحكام.
أمسك الرف بالملقط الخشن الطويل ، واغمره برفق في النيتروجين السائل حتى تتجمد العينة تماما. بعد ذلك ، قم بإزالة الرف من النيتروجين السائل وضعه على الثلج. قم بإذابة العينة ومراقبتها كل 15 ثانية حتى تصبح شفافة بشكل واضح.
بعد تكرار عملية التجميد والذوبان خمس مرات ، ضع العينة على الثلج. أضف ميكرولترين من تخليق الحمض النووي التكميلي Master Mix إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يحتوي على محللة بطيئات المشية. قم بنفض الأنبوب لفترة وجيزة وقم بتدويره على حرارة 2000 جم لمدة خمس ثوان في درجة حرارة الغرفة وضع العينة على الثلج.
الآن ، قم بتحميل العينة في جهاز تدوير حراري وابدأ برنامج تخليق (كدنا). بعد اكتمال التوليف ، ضع الأنبوب على الفور على الجليد. خفف العينة إلى حجم إجمالي قدره 25 ميكرولتر مع 21 ميكرولتر من الماء المعقم الخالي من النوكلياز.
حقق البروتوكول المحسن زيادة بمقدار ثلاثة أضعاف في إنتاجية الحمض النووي التكميلية مقارنة بالبروتوكولات التي لا تحتوي على دورات تجميد وذوبان الجليد ، مع كون ست دورات هي الأمثل. لم ينجح استخراج الحمض النووي الريبي عند وجود الماء المتبقي ، مما يدل على الحاجة الماسة لإزالة الماء الزائد من أجل التحلل المتسق. كان عائد الحمض النووي الريبي حوالي 14.24 نانوغرام لكل بطيئات المشية.
كان هذا البروتوكول أكثر كفاءة بأكثر من 200 مرة من مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي في إنتاجية نسخة الأكتين ، كما يتضح من انخفاض قيم Ct بشكل ملحوظ وتضخيم قوي لنطاق الهلام.
