Estamos focados em descobrir os mecanismos moleculares de neurorresiliência no tardígrado extremotolerante Hypsibius exemplaris. Estudamos as mudanças do sistema nervoso após a exposição a ambientes extremos. Descobrimos mudanças em grande escala nas estruturas neuroanatômicas e na função motora em tardígrados depois que eles experimentaram ambientes extremos.
O uso de tardígrados como organismo modelo para pesquisa em biologia molecular é relativamente novo. Como tal, existem muitas técnicas que ainda não estão totalmente otimizadas para sua aplicação em tardígrados. Embora tenhamos feito avanços notáveis em transcriptômica, proteômica e transgênese, ainda existem métodos e ferramentas necessários para a verificação e avaliação funcional de proteínas-alvo que permanecem subdesenvolvidas.
Os protocolos atuais para extrações de RNA de tardígrados únicos ainda não foram aplicados à qPCR ou requerem vários animais para extrações. Para continuar nosso trabalho na neurobiologia molecular do tardígrado, precisávamos de uma maneira de extrair e quantificar o RNA derivado de animais individuais para, primeiro, confirmar os resultados do sequenciamento de RNA, segundo, avaliar a eficiência do RNAi em animais injetados individualmente e, três, explorar variações individuais nas mudanças transcricionais entre as populações. Nosso método melhora as técnicas anteriores de três maneiras.
Diminui o tempo de extração em aproximadamente 30% em comparação com os métodos anteriores de extração de tardígrados únicos. Nosso método também diminui o custo das extrações em mais de 100 vezes, pois ignora a necessidade de etapa de amplificação linear por PCR. Finalmente, nosso método é 200 vezes mais eficiente do que os métodos anteriores, pois ignora a necessidade de purificação, o que geralmente resulta em perda significativa de RNA.
Nossas descobertas permitirão que os pesquisadores de tardígrados quantifiquem os níveis relativos de transcrição via qRT-PCR de tardígrados individuais de maneira eficiente e de baixo custo. Vemos isso sendo usado para quantificar a eficiência do knockdown de RNAi de maneira altamente quantitativa, confirmar acertos de sequenciamento e explorar diferenças individuais na resposta transcricional em vários animais. Para começar, acenda um bico de Bunsen ou outra fonte de chama controlada em uma configuração baixa.
Segure uma micropipeta de vidro com uma extremidade em cada mão e posicione seu centro sobre a chama até que o vidro comece a derreter. Depois de amolecido, afaste rapidamente as duas pontas para criar duas pontas afiadas. Em seguida, usando uma pinça fina estéril, quebre levemente a ponta da micropipeta para ajustar sua nitidez.
Prenda uma micropipeta de vidro em um extrator de micropipeta, evitando o contato com o filamento de aquecimento. Como ponto de partida para otimização, defina o polar para 78 graus Celsius com um único passo de tração usando um peso de tração de 182,2 gramas. Deixe o filamento aquecer, fazendo com que a micropipeta de vidro se separe em duas micropipetas com pontas afiadas devido à gravidade.
Armazene as micropipetas de vidro puxado em uma placa de Petri fechada de 100 milímetros e prenda-as com cera ou argila para evitar que as pontas afiadas se quebrem. Para começar, obtenha as micropipetas de vidro puxado das dimensões desejadas. Em seguida, prepare o Master Mix de síntese de DNA complementar e o tampão de lise de tardígrados.
Alíquota tampão de lise suficiente para extrações usando dois microlitros por tardígrado. Adicione o inibidor da ribonuclease ao tampão de lise para atingir uma concentração final de quatro unidades por microlitro. Vortex a solução brevemente e, em seguida, gire-a em uma centrífuga de mesa a 2000g por cinco segundos em temperatura ambiente.
Armazene a solução no gelo. Usando uma pipeta P1000 com ponta de filtro estéril, remova o número necessário de tardígrados da cultura e coloque-os em uma placa de Petri estéril de 35 milímetros. Lave os tardígrados três vezes com um mililitro de água de nascente estéril autoclavada para remover contaminantes de algas.
Coloque a placa sob um microscópio de dissecação com ampliação de 25X a 50X e use uma pipeta P10 com ponta de filtro para transferir um único tardígrado para uma nova placa de Petri estéril de 35 milímetros. Agora, com uma pipeta P200 com ponta de filtro estéril, lave o tardígrado único em 100 microlitros de água estéril sem nuclease. Transfira o tardígrado lavado para um tubo de PCR estéril limpo em um a dois microlitros de água estéril sem nuclease.
Visualize o tardígrado sob um microscópio de dissecação com ampliação de 25X. Para facilitar a remoção da água, quebre a ponta da micropipeta de vidro puxado levemente fora do tubo. Usando a ação capilar da micropipeta de vidro, remova a água até que o tardígrado esteja envolvido por uma pequena bolha de água.
Adicione dois microlitros de tampão de lise de tardígrado ao tubo. Após o vórtice brevemente, centrifugue o tubo à temperatura ambiente por cinco segundos a 2000g e armazene a amostra no gelo. Em seguida, coloque a amostra contendo tardígrados em um suporte de tubo de PCR e prenda-o firmemente.
Segurando o rack com uma pinça longa e grossa, mergulhe-o suavemente em nitrogênio líquido até que a amostra esteja totalmente congelada. Em seguida, remova o rack do nitrogênio líquido e coloque-o no gelo. Descongele a amostra, monitorando-a a cada 15 segundos até que fique visivelmente transparente.
Depois de repetir o processo de congelamento e descongelamento cinco vezes, coloque a amostra no gelo. Adicione dois microlitros de Master Mix de síntese de DNA complementar ao tubo de PCR contendo lisado de tardígrado. Agite brevemente o tubo e gire-o a 2000g por cinco segundos em temperatura ambiente e coloque a amostra no gelo.
Agora, carregue a amostra em um termociclador e inicie o programa de síntese de cDNA. Após a conclusão da síntese, coloque imediatamente o tubo no gelo. Diluir a amostra até um volume total de 25 microlitros com 21 microlitros de água estéril sem nuclease.
O protocolo otimizado alcançou um aumento de três vezes no rendimento de DNA complementar em comparação com protocolos sem ciclos de congelamento e descongelamento, com seis ciclos sendo ótimos. A extração de RNA não teve sucesso quando a água residual estava presente, demonstrando a necessidade crítica de remover o excesso de água para uma lise consistente. O rendimento do RNA foi de cerca de 14,24 nanogramas por tardígrado.
Este protocolo foi mais de 200 vezes mais eficiente do que os kits de extração de RNA no rendimento do transcrito de actina, conforme demonstrado por valores de Ct significativamente mais baixos e amplificação robusta da banda de gel.
