Nous nous concentrons sur la découverte des mécanismes moléculaires de la neurorésilience chez le tardigrade extremotolérant Hypsibius exemplaris. Nous étudions les modifications du système nerveux après une exposition à des environnements extrêmes. Nous avons découvert des changements à grande échelle dans les structures neuroanatomiques et la fonction motrice chez les tardigrades après qu’ils aient expérimenté des environnements extrêmes.
L’utilisation des tardigrades comme organisme modèle pour la recherche en biologie moléculaire est relativement nouvelle. En tant que telles, il existe de nombreuses techniques qui ne sont pas encore entièrement optimisées pour leur application dans les tardigrades. Bien que nous ayons fait des progrès remarquables en transcriptomique, en protéomique et en transgénèse, il existe encore des méthodes et des outils nécessaires pour la vérification et l’évaluation fonctionnelle des protéines cibles qui restent sous-développées.
Les protocoles actuels pour l’extraction d’ARN à partir de tardigrades uniques n’ont pas encore été appliqués à la qPCR ou nécessitent plusieurs animaux pour les extractions. Pour poursuivre nos travaux sur la neurobiologie moléculaire du tardigrade, nous avions besoin d’un moyen d’extraire et de quantifier l’ARN dérivé d’animaux individuels pour, premièrement, confirmer les résultats du séquençage de l’ARN, deuxièmement, évaluer l’efficacité de l’ARNi chez les animaux injectés individuellement, et troisièmement, explorer les variances individuelles dans les changements transcriptionnels entre les populations. Notre méthode améliore les techniques précédentes de trois manières.
Il réduit le temps d’extraction d’environ 30 % par rapport aux méthodes d’extraction par tardigrade unique précédentes. Notre méthode réduit également le coût des extractions de plus de 100 fois car elle contourne la nécessité d’une étape d’amplification PCR linéaire. Enfin, notre méthode est 200 fois plus efficace que les méthodes précédentes car elle contourne la nécessité d’une purification, ce qui entraîne souvent une perte importante d’ARN.
Nos résultats permettront aux chercheurs sur les tardigrades de quantifier les niveaux relatifs de transcrits via qRT-PCR à partir de tardigrades individuels de manière peu coûteuse et efficace. Nous le voyons utilisé pour quantifier l’efficacité de l’inactivation de l’ARNi de manière hautement quantitative, confirmer les résultats du séquençage et explorer les différences individuelles dans la réponse transcriptionnelle entre divers animaux. Pour commencer, allumez un bec Bunsen ou une autre source de flamme contrôlée à basse température.
Tenez une micropipette en verre avec une extrémité dans chaque main et positionnez son centre sur la flamme jusqu’à ce que le verre commence à fondre. Une fois ramollis, écartez rapidement les deux extrémités pour créer deux pointes pointues. Ensuite, à l’aide d’une paire de pinces fines stériles, cassez légèrement l’extrémité de la micropipette pour ajuster sa netteté.
Fixez une micropipette en verre sur un extracteur de micropipette, en évitant tout contact avec le filament chauffant. Comme point de départ pour l’optimisation, réglez la polaire à 78 degrés Celsius d’un seul pas de traction en utilisant un poids de traction de 182,2 grammes. Laissez chauffer le filament, ce qui permet à la micropipette en verre de se séparer en deux micropipettes à pointes acérées dues à la gravité.
Rangez les micropipettes en verre tiré dans une boîte de Pétri fermée de 100 millimètres et fixez-les avec de la cire ou de l’argile pour éviter que les pointes pointues ne se cassent. Pour commencer, procurez-vous les micropipettes en verre tiré des dimensions souhaitées. Préparez ensuite le Master Mix de synthèse d’ADN complémentaire et le tampon de lyse tardigrade.
Aliquote suffisamment de tampon de lyse pour les extractions à l’aide de deux microlitres par tardigrade. Ajoutez un inhibiteur de ribonucléase au tampon de lyse pour obtenir une concentration finale de quatre unités par microlitre. Vortex brièvement la solution, puis faites-la tourner dans une centrifugeuse de table à 2000 g pendant cinq secondes à température ambiante.
Conservez la solution sur de la glace. À l’aide d’une pipette P1000 à pointe filtrante stérile, prélevez le nombre requis de tardigrades de la culture et placez-les dans une boîte de Pétri stérile de 35 millimètres. Lavez les tardigrades trois fois avec un millilitre d’eau de source stérile autoclavée pour éliminer les contaminants d’algues.
Placez la boîte sous un microscope de dissection avec un grossissement de 25X à 50X et utilisez une pipette P10 à pointe filtrante pour transférer un seul tardigrade dans une nouvelle boîte de Pétri stérile de 35 millimètres. Maintenant, avec une pipette P200 à pointe de filtre stérile, lavez le tardigrade unique dans 100 microlitres d’eau stérile sans nucléases. Transférez le tardigrade lavé dans un tube PCR stérile propre dans un à deux microlitres d’eau stérile sans nucléases.
Visualisez le tardigrade sous un microscope à dissection à un grossissement de 25X. Pour faciliter l’évacuation de l’eau, cassez légèrement l’extrémité de la micropipette en verre tiré à l’extérieur du tube. À l’aide de l’action capillaire de la micropipette en verre, prélevez l’eau jusqu’à ce que le tardigrade soit entouré d’une petite bulle d’eau.
Ajoutez deux microlitres de tampon de lyse tardigrade dans le tube. Après un vortex, centrifugez brièvement le tube à température ambiante pendant cinq secondes à 2000 g et stockez l’échantillon sur de la glace. Placez ensuite l’échantillon contenant des tardigrades dans un support de tube PCR et fixez-le fermement.
En saisissant le support à l’aide d’une longue pince grossière, plongez-le doucement dans l’azote liquide jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement congelé. Ensuite, retirez la grille de l’azote liquide et placez-la sur de la glace. Décongelez l’échantillon en le surveillant toutes les 15 secondes jusqu’à ce qu’il devienne visiblement transparent.
Après avoir répété le processus de congélation-décongélation cinq fois, placez l’échantillon sur de la glace. Ajoutez deux microlitres de Master Mix de synthèse d’ADN complémentaire dans le tube PCR contenant du lysat de tardigrade. Retournez brièvement le tube et faites-le tourner à 2000 g pendant cinq secondes à température ambiante et placez l’échantillon sur de la glace.
Maintenant, chargez l’échantillon dans un thermocycleur et démarrez le programme de synthèse de l’ADNc. Une fois la synthèse terminée, placez immédiatement le tube sur de la glace. Diluez l’échantillon à un volume total de 25 microlitres avec 21 microlitres d’eau stérile sans nucléases.
Le protocole optimisé a permis de tripler le rendement en ADN complémentaire par rapport aux protocoles sans cycles de gel-dégel, six cycles étant optimaux. L’extraction de l’ARN n’a pas réussi en présence d’eau résiduelle, ce qui démontre la nécessité cruciale d’éliminer l’excès d’eau pour une lyse constante. Le rendement en ARN était d’environ 14,24 nanogrammes par tardigrade.
Ce protocole était plus de 200 fois plus efficace que les kits d’extraction d’ARN en termes de rendement de transcription d’actine, comme le démontrent des valeurs Ct nettement inférieures et une amplification robuste de la bande de gel.
