Мы сосредоточены на раскрытии молекулярных механизмов нейроустойчивости у экстремально толерантной тихоходки Hypsibius exemplaris. Мы изучаем изменения нервной системы после воздействия экстремальных условий. Мы обнаружили широкомасштабные изменения в нейроанатомических структурах и двигательной функции у тихоходок после того, как они испытали экстремальные условия окружающей среды.
Использование тихоходок в качестве модельного организма для молекулярно-биологических исследований является относительно новым. Таким образом, существует множество методов, которые еще не полностью оптимизированы для их применения у тихоходок. Несмотря на то, что мы добились замечательных успехов в транскриптомике, протеомике и трансгенезе, все еще существуют методы и инструменты, необходимые для верификации и функциональной оценки белков-мишеней, которые остаются недоработанными.
Существующие протоколы экстракции РНК у одиночных тихоходок еще не применяются к количественной ПЦР и не требуют нескольких животных для экстракции. Чтобы продолжить нашу работу над молекулярной нейробиологией тихоходок, нам нужен был способ извлечения и количественного определения РНК, полученной от отдельных животных, чтобы, во-первых, подтвердить результаты секвенирования РНК, во-вторых, оценить эффективность РНК-интерференции у животных, которым вводили индивидуально, и, в-третьих, изучить индивидуальные различия в транскрипционных изменениях в популяциях. Наш метод улучшает предыдущие методики по трем направлениям.
Это сокращает время экстракции примерно на 30% по сравнению с предыдущими методами экстракции с одиночной тихоходкой. Наш метод также снижает стоимость экстракции более чем в 100 раз, поскольку он позволяет избежать необходимости в этапе линейной амплификации ПЦР. Наконец, наш метод в 200 раз эффективнее предыдущих методов, поскольку он позволяет избежать необходимости очистки, которая часто приводит к значительной потере РНК.
Наши результаты позволят исследователям тихоходок количественно оценить относительные уровни транскриптов с помощью qRT-PCR у отдельных тихоходок недорогим и эффективным способом. Мы видим, как это используется для количественной оценки эффективности нокдауна РНК-интерференции в высококоличественной степени, подтверждения попаданий в секвенирование и изучения индивидуальных различий в транскрипционном ответе у различных животных. Для начала зажгите горелку Бунзена или другой контролируемый источник пламени на слабом уровне.
Держите стеклянную микропипетку одним концом в каждой руке и расположите ее центр над пламенем, пока стекло не начнет плавиться. После размягчения быстро раздвиньте два конца, чтобы получились два острых кончика. Затем с помощью пары стерильных тонких щипцов слегка сломайте кончик микропипетки, чтобы отрегулировать ее остроту.
Закрепите стеклянную микропипетку на съемнике микропипетки, избегая контакта с нагревательной нитью. В качестве отправной точки для оптимизации установите полярность на 78 градусов Цельсия с одним шагом тяги, используя тяговый груз в 182,2 грамма. Дайте нити нагреться, в результате чего стеклянная микропипетка разделится на две микропипетки с острыми концами под действием силы тяжести.
Храните вытянутые стеклянные микропипетки в закрытой 100-миллиметровой чашке Петри и закрепите их воском или глиной, чтобы острые кончики не сломались. Для начала получите вытягиваемые стеклянные микропипетки желаемых размеров. Затем приготовьте комплементарный синтез ДНК Master Mix и буфер для лизиса тихоходки.
Аликвота достаточный буфер для лизиса для экстракции с использованием двух микролитров на одну тихоходку. Добавьте ингибитор рибонуклеазы в буфер для лизиса для достижения конечной концентрации в четыре единицы на микролитр. Быстро перебейте раствор в вихрь, затем раскрутите его в настольной центрифуге при весе 2000 г в течение пяти секунд при комнатной температуре.
Храните раствор на льду. С помощью стерильного фильтра с наконечником пипетки Р1000 удалите необходимое количество тихоходок из культуры и поместите их в стерильную 35-миллиметровую чашку Петри. Вымойте тихоходок три раза одним миллилитром стерильной родниковой воды, чтобы удалить водорослевые загрязнения.
Поместите чашку под препарирующий микроскоп с увеличением от 25X до 50X и с помощью пипетки P10 с фильтром перенесите одну тихоходку в новую стерильную 35-миллиметровую чашку Петри. Теперь с помощью стерильного фильтра с наконечником пипетки P200 промойте одиночную тихоходку в 100 микролитрах стерильной воды, не содержащей нуклеаз. Переложите промытую тихоходку в чистую стерильную ПЦР-пробирку в одном-двух микролитрах стерильной воды, не содержащей нуклеазы.
Визуализируйте тихоходку под препарирующим микроскопом при 25-кратном увеличении. Чтобы облегчить удаление воды, слегка разбейте кончик вытянутой стеклянной микропипетки за пределы пробирки. С помощью капиллярного действия стеклянной микропипетки удаляйте воду до тех пор, пока тихоходка не будет окружена маленьким пузырьком воды.
Добавьте в пробирку два микролитра буфера для лизиса тихоходки. После кратковременного вортекса центрифугируйте пробирку при комнатной температуре в течение пяти секунд при весе 2000г и храните образец на льду. Затем поместите образец, содержащий тихоходок, в штатив для пробирок для ПЦР и плотно закрепите его.
Обхватив штатив длинными грубыми щипцами, аккуратно погрузите его в жидкий азот до полного замерзания образца. Далее извлеките решетку из жидкого азота и поставьте ее на лед. Разморозьте образец, контролируя его каждые 15 секунд, пока он не станет заметно прозрачным.
Повторив процесс замораживания-размораживания пять раз, поместите образец на лед. Добавьте два микролитра комплементарного синтеза ДНК Master Mix в ПЦР-пробирку, содержащую лизат тихоходки. Кратковременно переверните пробирку и вращайте ее при температуре 2000 г в течение пяти секунд при комнатной температуре и поместите образец на лед.
Теперь загрузите образец в амплификатор и запустите программу синтеза кДНК. После того как синтез будет завершен, сразу же поместите пробирку на лед. Разбавьте образец до общего объема 25 микролитров 21 микролитром стерильной воды, не содержащей нуклеаз.
Оптимизированный протокол позволил достичь трехкратного увеличения выхода комплементарной ДНК по сравнению с протоколами без циклов замораживания-размораживания, при этом оптимальными являются шесть циклов. Экстракция РНК была неудачной при наличии остаточной воды, что свидетельствует о критической необходимости удаления лишней воды для последовательного лизиса. Выход РНК составлял около 14,24 нанограмма на тихоходку.
Этот протокол был более чем в 200 раз эффективнее наборов для экстракции РНК по выходу актинового транскрипта, о чем свидетельствуют значительно более низкие значения Ct и надежная амплификация гелевых полос.
