Wir konzentrieren uns auf die Aufdeckung der molekularen Mechanismen der Neuroresilienz beim extremotoleranten Bärtierchen Hypsibius exemplaris. Wir untersuchen Veränderungen des Nervensystems nach der Exposition gegenüber extremen Umgebungen. Wir haben großflächige Veränderungen der neuroanatomischen Strukturen und der motorischen Funktion bei Bärtierchen entdeckt, nachdem sie extremen Umweltbedingungen ausgesetzt waren.
Die Verwendung von Bärtierchen als Modellorganismus für die molekularbiologische Forschung ist relativ neu. Daher gibt es viele Techniken, die noch nicht vollständig für ihre Anwendung bei Bärtierchen optimiert sind. Obwohl wir bemerkenswerte Fortschritte in der Transkriptomik, Proteomik und Transgenese gemacht haben, gibt es immer noch Methoden und Werkzeuge, die für die Verifizierung und funktionelle Bewertung von Zielproteinen erforderlich sind, die noch unterentwickelt sind.
Aktuelle Protokolle für RNA-Extraktionen aus einzelnen Bärtierchen wurden bisher nicht auf die qPCR angewendet oder erfordern mehrere Tiere für die Extraktion. Um unsere Arbeit an der molekularen Neurobiologie des Bärtierchens fortzusetzen, brauchten wir eine Möglichkeit, RNA von einzelnen Tieren zu extrahieren und zu quantifizieren, um erstens die Ergebnisse der RNA-Sequenzierung zu bestätigen, zweitens die RNAi-Effizienz bei einzeln injizierten Tieren zu bewerten und drittens individuelle Varianzen in transkriptionellen Veränderungen zwischen Populationen zu untersuchen. Unsere Methode verbessert frühere Techniken in dreierlei Hinsicht.
Es verkürzt die Extraktionszeit um ca. 30% im Vergleich zu früheren Extraktionsmethoden mit einfachem Bärtierchen. Unsere Methode senkt auch die Kosten für Extraktionen um mehr als das 100-fache, da sie die Notwendigkeit eines linearen PCR-Amplifikationsschritts umgeht. Schließlich ist unsere Methode 200-mal effizienter als frühere Methoden, da sie die Notwendigkeit einer Reinigung umgeht, die oft zu einem erheblichen Verlust von RNA führt.
Unsere Ergebnisse werden es Bärtierchenforschern ermöglichen, die relativen Transkriptspiegel von einzelnen Bärtierchen kostengünstig und effizient per qRT-PCR zu quantifizieren. Wir sehen, dass dies genutzt wird, um die Effizienz des RNAi-Knockdowns auf hochquantitative Weise zu quantifizieren, Sequenzierungstreffer zu bestätigen und individuelle Unterschiede in der Transkriptionsreaktion bei verschiedenen Tieren zu untersuchen. Zünden Sie zunächst einen Bunsenbrenner oder eine andere kontrollierte Flammenquelle auf niedriger Stufe an.
Halten Sie eine Glasmikropipette mit einem Ende in jeder Hand und positionieren Sie ihre Mitte über der Flamme, bis das Glas zu schmelzen beginnt. Sobald sie weich sind, ziehe die beiden Enden schnell auseinander, um zwei scharfe Spitzen zu bilden. Brechen Sie dann mit einer sterilen feinen Pinzette die Spitze der Mikropipette leicht, um ihre Schärfe anzupassen.
Befestigen Sie eine Mikropipette aus Glas an einem Mikropipettenabzieher und vermeiden Sie den Kontakt mit dem Heizfaden. Als Ausgangspunkt für die Optimierung stellen Sie die Polarisation mit einem einzigen Zugschritt bei einem Zuggewicht von 182,2 Gramm auf 78 Grad Celsius ein. Lassen Sie das Filament erhitzen, wodurch sich die Glasmikropipette aufgrund der Schwerkraft in zwei Mikropipetten mit scharfen Spitzen trennt.
Bewahren Sie die gezogenen Glas-Mikropipetten in einer geschlossenen 100-Millimeter-Petrischale auf und sichern Sie sie mit Wachs oder Tonerde, um ein Brechen der scharfen Spitzen zu verhindern. Besorgen Sie sich zunächst die gezogenen Glasmikropipetten in den gewünschten Abmessungen. Bereiten Sie dann den komplementären DNA-Synthese-Mastermix und den Bärtierchen-Lysepuffer vor.
Aliquot ausreichender Lysepuffer für Extraktionen mit zwei Mikrolitern pro Bärtierchen. Geben Sie dem Lysepuffer einen Ribonuklease-Hemmer, um eine Endkonzentration von vier Einheiten pro Mikroliter zu erreichen. Die Lösung kurz vortexen und dann in einer Tischzentrifuge bei 2000 g fünf Sekunden lang bei Raumtemperatur eindrehen.
Lagern Sie die Lösung auf Eis. Entfernen Sie mit einer P1000-Pipette mit Sterilfilter die erforderliche Anzahl von Bärtierchen aus der Kultur und geben Sie sie in eine sterile 35-Millimeter-Petrischale. Waschen Sie die Bärtierchen dreimal mit einem Milliliter autoklaviertem sterilem Quellwasser, um Algenverunreinigungen zu entfernen.
Stellen Sie die Schale unter ein Präpariermikroskop mit 25- bis 50-facher Vergrößerung und verwenden Sie eine P10-Pipette mit Filterspitze, um ein einzelnes Bärtierchen in eine neue sterile 35-Millimeter-Petrischalen zu übertragen. Waschen Sie nun mit einer P200-Pipette mit Sterilfilterspitze das einzelne Bärtierchen in 100 Mikrolitern sterilem, nukleasefreiem Wasser. Übertragen Sie das gewaschene Bärtierchen in ein sauberes steriles PCR-Röhrchen in ein sauberes steriles PCR-Röhrchen in ein bis zwei Mikroliter steriles, nukleasefreies Wasser.
Visualisieren Sie das Bärtierchen unter einem Präpariermikroskop bei 25-facher Vergrößerung. Um die Wasserentnahme zu erleichtern, brechen Sie die Spitze der gezogenen Glasmikropipette leicht außerhalb des Röhrchens. Mit der Kapillarwirkung der Glasmikropipette wird das Wasser entfernt, bis das Bärtierchen von einer kleinen Wasserblase umgeben ist.
Geben Sie zwei Mikroliter Bärtierchen-Lysepuffer in das Röhrchen. Nach dem kurzen Vortexen zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Sekunden lang bei Raumtemperatur bei 2000 g und lagern Sie die Probe auf Eis. Legen Sie dann die Probe mit den Bärtierchen in ein PCR-Röhrchengestell und befestigen Sie es.
Fassen Sie das Gestell mit einer langen, groben Pinzette und tauchen Sie es vorsichtig in flüssigen Stickstoff, bis die Probe vollständig gefroren ist. Als nächstes nimmst du das Gestell vom flüssigen Stickstoff und legst es auf Eis. Tauen Sie die Probe auf und überwachen Sie sie alle 15 Sekunden, bis sie sichtbar transparent wird.
Nachdem Sie den Gefrier-Tau-Vorgang fünfmal wiederholt haben, legen Sie die Probe auf Eis. Geben Sie zwei Mikroliter komplementären DNA-Synthese-Mastermix in das PCR-Röhrchen mit Bärtierchenlysat. Schnippen Sie kurz mit dem Röhrchen und drehen Sie es fünf Sekunden lang bei Raumtemperatur bei 2000 g und legen Sie die Probe auf Eis.
Laden Sie nun die Probe in einen Thermocycler und starten Sie das cDNA-Syntheseprogramm. Nachdem die Synthese abgeschlossen ist, stellen Sie das Röhrchen sofort auf Eis. Verdünnen Sie die Probe auf ein Gesamtvolumen von 25 Mikrolitern mit 21 Mikrolitern sterilem nukleasefreiem Wasser.
Das optimierte Protokoll erreichte eine dreifache Steigerung der komplementären DNA-Ausbeute im Vergleich zu Protokollen ohne Gefrier-Tau-Zyklen, wobei sechs Zyklen optimal waren. Die RNA-Extraktion war nicht erfolgreich, wenn Restwasser vorhanden war, was die dringende Notwendigkeit zeigt, überschüssiges Wasser für eine konsistente Lyse zu entfernen. Die RNA-Ausbeute lag bei etwa 14,24 Nanogramm pro Bärtierchen.
Dieses Protokoll war bei der Aktintranskriptausbeute über 200-mal effizienter als RNA-Extraktionskits, was durch signifikant niedrigere Ct-Werte und eine robuste Gelbandenamplifikation gezeigt wurde.
