Ekstremotolerant tardigrad Hypsibius exemplaris'teki nörodirencin moleküler mekanizmalarını ortaya çıkarmaya odaklandık. Aşırı ortamlara maruz kaldıktan sonra sinir sistemi değişikliklerini inceliyoruz. Aşırı ortamları deneyimledikten sonra tardigradlarda nöroanatomik yapılarda ve motor fonksiyonlarda büyük ölçekli değişiklikler keşfettik.
Tardigradların moleküler biyolojik araştırmalar için bir model organizma olarak kullanımı nispeten yenidir. Bu nedenle, tardigradlardaki uygulamaları için henüz tam olarak optimize edilmemiş birçok teknik vardır. Transkriptomik, proteomik ve transgenezde kayda değer adımlar atmış olsak da, az gelişmiş olan hedef proteinlerin doğrulanması ve fonksiyonel değerlendirmesi için hala gerekli yöntemler ve araçlar bulunmaktadır.
Tek tardigradlardan RNA ekstraksiyonları için mevcut protokoller henüz qPCR'ye uygulanmamıştır veya ekstraksiyonlar için birden fazla hayvan gerektirmemiştir. Tardigradın moleküler nörobiyolojisi üzerindeki çalışmalarımıza devam etmek için, ilk olarak bireysel hayvanlardan türetilen RNA'yı çıkarmak ve ölçmek için bir yola ihtiyacımız vardı, ilk olarak, RNA dizileme bulgularını doğrulamak, ikincisi, bireysel olarak enjekte edilen hayvanlarda RNAi verimliliğini değerlendirmek ve üç, popülasyonlar arasındaki transkripsiyonel değişikliklerdeki bireysel varyansları keşfetmek. Yöntemimiz önceki teknikleri üç şekilde geliştirir.
Önceki tek tardigrad ekstraksiyon yöntemlerine kıyasla ekstraksiyon süresini yaklaşık% 30 oranında azaltır. Yöntemimiz ayrıca lineer PCR amplifikasyon adımına olan ihtiyacı ortadan kaldırdığı için ekstraksiyon maliyetini 100 kattan fazla azaltır. Son olarak, yöntemimiz önceki yöntemlere göre 200 kat daha verimlidir, çünkü saflaştırma ihtiyacını ortadan kaldırır ve bu da genellikle önemli ölçüde RNA kaybına neden olur.
Bulgularımız, tardigrad araştırmacılarının, bireysel tardigradlardan qRT-PCR yoluyla göreceli transkript seviyelerini düşük maliyetli ve verimli bir şekilde ölçmelerine olanak tanıyacaktır. Bunun, RNAi yıkımının verimliliğini oldukça nicel bir şekilde ölçmek, sıralama isabetlerini doğrulamak ve çeşitli hayvanlar arasında transkripsiyonel yanıttaki bireysel farklılıkları keşfetmek için kullanıldığını görüyoruz. Başlamak için, bir Bunsen brülörünü veya başka bir kontrollü alev kaynağını düşük ayarda yakın.
Her iki elinizde bir ucu olacak şekilde bir cam mikropipet tutun ve cam erimeye başlayana kadar merkezini alevin üzerine yerleştirin. Yumuşatıldıktan sonra, iki keskin uç oluşturmak için iki ucu hızla ayırın. Ardından, bir çift steril ince forseps kullanarak, keskinliğini ayarlamak için mikropipetin ucunu hafifçe kırın.
Isıtma filamenti ile temastan kaçınarak bir cam mikropipeti bir mikropipet çekiciye sabitleyin. Optimizasyon için bir başlangıç noktası olarak, 182,2 gramlık bir çekme ağırlığı kullanarak tek bir çekme adımıyla poları 78 santigrat dereceye ayarlayın. Filamentin ısınmasına izin verin, bu da cam mikropipetin yerçekimi nedeniyle keskin noktalara sahip iki mikropipete ayrılmasına neden olur.
Çekilmiş cam mikropipetleri 100 milimetrelik kapalı bir Petri kabında saklayın ve keskin uçların kırılmasını önlemek için balmumu veya kil ile sabitleyin. Başlamak için, istenen boyutlarda çekilmiş cam mikropipetleri edinin. Daha sonra tamamlayıcı DNA sentezi Master Mix'i ve tardigrad lizis tamponunu hazırlayın.
Tardigrad başına iki mikrolitre kullanan ekstraksiyonlar için yeterli lizis tamponu bulundurun. Mikrolitre başına dört birimlik bir nihai konsantrasyon elde etmek için lizis tamponuna ribonükleaz inhibitörü ekleyin. Çözeltiyi kısa bir süre girdaplayın, ardından oda sıcaklığında beş saniye boyunca 2000 g'lık bir masa üstü santrifüjde döndürün.
Çözeltiyi buz üzerinde saklayın. Steril bir filtre uçlu P1000 pipet kullanarak, gerekli sayıda tardigradı kültürden çıkarın ve bunları 35 milimetrelik steril bir Petri kabına yerleştirin. Alg kirleticilerini gidermek için tardigradları bir mililitre otoklavlanmış steril kaynak suyu ile üç kez yıkayın.
Çanağı 25X ila 50X büyütmeli bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin ve tek bir tardigradı yeni bir steril 35 milimetrelik Petri kabına aktarmak için filtre uçlu bir P10 pipet kullanın. Şimdi, steril filtre uçlu P200 pipet ile tek tardigradı 100 mikrolitre steril nükleaz içermeyen suda yıkayın. Yıkanmış tardigradı bir ila iki mikrolitre steril nükleaz içermeyen su içinde temiz, steril bir PCR tüpüne aktarın.
Tardigradı 25X büyütmede diseksiyon mikroskobu altında görselleştirin. Suyun çıkarılmasını kolaylaştırmak için, çekilen cam mikropipetin ucunu tüpün dışına hafifçe kırın. Cam mikropipetin kılcal hareketini kullanarak, tardigrad küçük bir su kabarcığı ile çevrelenene kadar suyu çıkarın.
Tüpe iki mikrolitre tardigrad lizis tamponu ekleyin. Girdaplamadan sonra, tüpü oda sıcaklığında 2000 g'da beş saniye santrifüjleyin ve numuneyi buz üzerinde saklayın. Ardından tardigrad içeren numuneyi bir PCR tüp rafına yerleştirin ve sıkıca sabitleyin.
Rafı uzun, kaba forsepslerle kavrayarak, numune tamamen donana kadar yavaşça sıvı nitrojene batırın. Ardından, rafı sıvı nitrojenden çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. Numuneyi çözün, gözle görülür şekilde şeffaf hale gelene kadar her 15 saniyede bir izleyin.
Dondurarak çözdürme işlemini beş kez tekrarladıktan sonra numuneyi buzun üzerine yerleştirin. Tardigrad lizat içeren PCR tüpüne iki mikrolitre tamamlayıcı DNA sentezi Master Mix ekleyin. Tüpü kısa bir süre hafifçe vurun ve oda sıcaklığında beş saniye boyunca 2000 g'da döndürün ve numuneyi buzun üzerine yerleştirin.
Şimdi, numuneyi bir termodöngüleyiciye yükleyin ve cDNA sentez programını başlatın. Sentez tamamlandıktan hemen sonra tüpü buzun üzerine yerleştirin. Numuneyi 21 mikrolitre steril nükleaz içermeyen su ile toplam 25 mikrolitre hacme kadar seyreltin.
Optimize edilmiş protokol, donma-çözülme döngüleri olmayan protokollere kıyasla tamamlayıcı DNA veriminde üç kat artış sağladı ve altı döngü optimaldi. Artık su mevcut olduğunda RNA ekstraksiyonu başarısız oldu, bu da tutarlı bir lizis için fazla suyun uzaklaştırılmasının kritik ihtiyacını gösterdi. RNA verimi, tardigrad başına yaklaşık 14.24 nanogram idi.
Bu protokol, önemli ölçüde daha düşük Ct değerleri ve sağlam jel bant amplifikasyonu ile gösterildiği gibi, aktin transkript veriminde RNA ekstraksiyon kitlerinden 200 kat daha verimliydi.
