אנו מתמקדים בחשיפת המנגנונים המולקולריים של עמידות עצבית בטרדיגרד האקסטרים Hypsibius exemplaris. אנו חוקרים שינויים במערכת העצבים לאחר חשיפה לסביבות קיצוניות. גילינו שינויים בקנה מידה גדול במבנים נוירו-אנטומיים ובתפקוד המוטורי בטרדיגראדים לאחר שהם חוו סביבות קיצוניות.
השימוש בטרדיגראדים כאורגניזם מודל למחקר ביולוגי מולקולרי הוא חדש יחסית. ככזה, ישנן טכניקות רבות שעדיין אינן מותאמות לחלוטין ליישום שלהן בטרדיגראדים. למרות שעשינו צעדים מדהימים בטרנסקריפטומיקה, פרוטאומיקה וטרנסגנזה, עדיין ישנן שיטות וכלים הנדרשים לאימות והערכה תפקודית של חלבוני מטרה שנותרו לא מפותחים.
הפרוטוקולים הנוכחיים למיצוי RNA מטרדיגראדים בודדים עדיין לא יושמו על qPCR או דורשים מספר בעלי חיים למיצוי. כדי להמשיך את עבודתנו על הנוירוביולוגיה המולקולרית של הטרדיגראד, היינו זקוקים לדרך לחלץ ולכמת RNA שמקורו בבעלי חיים בודדים כדי ראשית, לאשר את ממצאי ריצוף הרנ"א, שנית, להעריך את יעילות ה-RNAi בבעלי חיים שהוזרקו בנפרד, ושלישית, לחקור שונות אינדיבידואלית בשינויי שעתוק בין אוכלוסיות. השיטה שלנו משפרת טכניקות קודמות בשלוש דרכים.
זה מקטין את זמן המיצוי בכ-30% בהשוואה לשיטות מיצוי קודמות של טרדיגראד בודד. השיטה שלנו גם מפחיתה את עלות המיצוי ביותר מפי 100 מכיוון שהיא עוקפת את הצורך בשלב הגברת PCR ליניארי. לבסוף, השיטה שלנו יעילה פי 200 מהשיטות הקודמות מכיוון שהיא עוקפת את הצורך בטיהור, מה שלעתים קרובות גורם לאובדן משמעותי של RNA.
הממצאים שלנו יאפשרו לחוקרי טרדיגראד לכמת את רמות התעתיק היחסיות באמצעות qRT-PCR מטרדיגראדים בודדים בעלות נמוכה ובצורה יעילה. אנו רואים שימוש בזה כדי לכמת את היעילות של הפלת RNAi בצורה כמותית ביותר, לאשר פגיעות רצף ולחקור הבדלים אינדיבידואליים בתגובת השעתוק בין בעלי חיים שונים. כדי להתחיל, הדליקו מבער Bunsen או מקור להבה מבוקר אחר בהגדרה נמוכה.
החזיקו מיקרופיפטה מזכוכית עם קצה אחד בכל יד ומקמו את מרכזה מעל הלהבה עד שהכוס מתחילה להימס. לאחר הריכוך, משוך במהירות את שני הקצוות זה מזה כדי ליצור שני קצוות חדים. לאחר מכן, בעזרת זוג מלקחיים עדינים סטריליים שוברים קלות את קצה המיקרופיפטה כדי להתאים את חדותו.
אבטח מיקרופיפטה מזכוכית על חולץ מיקרופיפטה, הימנע ממגע עם חוט החימום. כנקודת התחלה לאופטימיזציה, הגדר את הקוטב ל-78 מעלות צלזיוס בצעד משיכה יחיד באמצעות משקל משיכה של 182.2 גרם. תנו לנימה להתחמם, מה שגורם למיקרופיפטת הזכוכית להיפרד לשתי מיקרופיפטות עם נקודות חדות עקב כוח הכבידה.
אחסן את המיקרופיפטות הזכוכית הנמשכות בצלחת פטרי סגורה בגודל 100 מילימטר ואבטח אותן בשעווה או בחימר כדי למנוע את שבירת הקצוות החדים. כדי להתחיל, השג את המיקרופיפטות הזכוכית המשוכות במידות הרצויות. לאחר מכן הכינו את סינתזת ה-DNA המשלימה מאסטר מיקס ומאגר ליזה טרדיגראד.
Aliquot מאגר ליזה מספיק למיצוי באמצעות שני מיקרוליטר לכל טרדיגראד. הוסף מעכב ריבונוקלאז למאגר הליזיס כדי להשיג ריכוז סופי של ארבע יחידות למיקרוליטר. מערבבים את התמיסה לזמן קצר, ואז מסובבים אותה בצנטריפוגה שולחנית ב-2000 גרם למשך חמש שניות בטמפרטורת החדר.
אחסן את התמיסה על קרח. בעזרת פילטר סטרילי, פיפטה P1000, הסר את המספר הנדרש של טרדיגרדים מהתרבית והניח אותם בצלחת פטרי סטרילית בגודל 35 מילימטר. שטפו את הטרדיגרדים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של מי מעיין סטריליים שעברו חיטוי כדי להסיר מזהמי אצות.
הניחו את המנה מתחת למיקרוסקופ מנתח עם הגדלה של פי 25 עד פי 50 והשתמשו בפיפטה P10 עם קצה מסנן כדי להעביר טרדיגראד בודד לצלחת פטרי סטרילית חדשה בגודל 35 מילימטר. כעת, עם פיפטה P200 עם קצה מסנן סטרילי, שטפו את הטרדיגראד היחיד ב-100 מיקרוליטר של מים סטריליים ללא נוקלאז. העבירו את הטרדיגרד השטוף לצינור PCR סטרילי נקי במיקרוליטר אחד עד שניים של מים סטריליים ללא נוקלאז.
דמיין את הטרדיגראד תחת מיקרוסקופ מנתח בהגדלה של פי 25. כדי להקל על פינוי המים, שברו קלות את קצה המיקרופיפטה הזכוכית הנמשכת מחוץ לצינור. באמצעות פעולת הנימים של מיקרופיפטת הזכוכית הסר מים עד שהטרדיגראד מוקף בבועת מים קטנה.
הוסף שני מיקרוליטר של מאגר ליזה טרדיגרד לצינור. לאחר מערבולת קצרה, צנטריפוגה את הצינור בטמפרטורת החדר למשך חמש שניות ב-2000 גרם ואחסן את הדגימה על קרח. לאחר מכן הנח את הדגימה המכילה טרדיגרדים לתוך מתלה צינור PCR ואבטח אותה היטב.
אוחזים במתלה בעזרת מלקחיים ארוכים וגסים, טובלים אותו בעדינות בחנקן נוזלי עד שהדגימה קפואה לחלוטין. לאחר מכן, הסר את המתלה מהחנקן הנוזלי והניח אותו על קרח. הפשירו את הדגימה, עקבו אחריה כל 15 שניות עד שהיא הופכת לשקופה בעליל.
לאחר חזרה על תהליך ההקפאה-הפשרה חמש פעמים, הניחו את הדגימה על קרח. הוסף שני מיקרוליטרים של סינתזת DNA משלימה Master Mix לצינור ה-PCR המכיל ליזאט טרדיגראד. העבירו בקצרה את הצינור וסובבו אותו ב-2000 גרם למשך חמש שניות בטמפרטורת החדר והניחו את הדגימה על קרח.
כעת, טען את הדגימה לתוך תרמו-סייקלר והתחל את תוכנית סינתזת ה-cDNA. לאחר השלמת הסינתזה הנח מיד את הצינור על קרח. מדללים את הדגימה לנפח כולל של 25 מיקרוליטר עם 21 מיקרוליטר מים סטריליים ללא נוקלאז.
הפרוטוקול האופטימלי השיג עלייה של פי שלושה בתפוקת ה-DNA המשלים בהשוואה לפרוטוקולים ללא מחזורי הקפאה-הפשרה, כאשר שישה מחזורים היו אופטימליים. מיצוי RNA לא הצליח כאשר היו שאריות מים, מה שמדגים את הצורך הקריטי בהסרת עודפי מים לליזה עקבית. תפוקת ה-RNA הייתה בסביבות 14.24 ננוגרם לטרדיגראד.
פרוטוקול זה היה יעיל פי 200 מערכות מיצוי RNA בתפוקת תעתיק אקטין, כפי שהוכח על ידי ערכי Ct נמוכים משמעותית והגברה חזקה של רצועת ג'ל.
