Nos centramos en descubrir los mecanismos moleculares de la neuroresiliencia en el tardígrado extremadamente tolerante Hypsibius exemplaris. Estudiamos los cambios en el sistema nervioso después de la exposición a ambientes extremos. Hemos descubierto cambios a gran escala en las estructuras neuroanatómicas y la función motora en los tardígrados después de haber experimentado entornos extremos.
El uso de tardígrados como organismo modelo para la investigación biológica molecular es relativamente nuevo. Como tal, hay muchas técnicas que aún no están completamente optimizadas para su aplicación en tardígrados. Aunque hemos hecho avances notables en transcriptómica, proteómica y transgénesis, todavía hay métodos y herramientas necesarios para la verificación y evaluación funcional de las proteínas objetivo que siguen estando subdesarrollados.
Los protocolos actuales para las extracciones de ARN de tardígrados individuales aún no se han aplicado a la qPCR o requieren múltiples animales para las extracciones. Para continuar nuestro trabajo en la neurobiología molecular del tardígrado, necesitábamos una forma de extraer y cuantificar el ARN derivado de animales individuales para, en primer lugar, confirmar los hallazgos de la secuenciación del ARN, en segundo lugar, evaluar la eficiencia del ARNi en animales inyectados individualmente y, en tercer lugar, explorar las variaciones individuales en los cambios transcripcionales entre las poblaciones. Nuestro método mejora las técnicas anteriores de tres maneras.
Disminuye el tiempo de extracción en aproximadamente un 30% en comparación con los métodos anteriores de extracción con un solo tardígrado. Nuestro método también disminuye el costo de las extracciones en más de 100 veces, ya que evita la necesidad de un paso de amplificación de PCR lineal. Finalmente, nuestro método es 200 veces más eficiente que los métodos anteriores, ya que evita la necesidad de una purificación, que a menudo resulta en una pérdida significativa de ARN.
Nuestros hallazgos permitirán a los investigadores de tardígrados cuantificar los niveles relativos de transcripción a través de qRT-PCR de tardígrados individuales de una manera eficiente y de bajo costo. Vemos que esto se utiliza para cuantificar la eficiencia de la eliminación de ARNi de una manera altamente cuantitativa, confirmar los aciertos de secuenciación y explorar las diferencias individuales en la respuesta transcripcional en varios animales. Para comenzar, encienda un mechero Bunsen u otra fuente de llama controlada a un nivel bajo.
Sostenga una micropipeta de vidrio con un extremo en cada mano y coloque su centro sobre la llama hasta que el vidrio comience a derretirse. Una vez que se ablanden, separe rápidamente los dos extremos para crear dos puntas afiladas. A continuación, con un par de pinzas finas estériles, rompa ligeramente la punta de la micropipeta para ajustar su nitidez.
Fije una micropipeta de vidrio en un extractor de micropipetas, evitando el contacto con el filamento calefactor. Como punto de partida para la optimización, ajuste el polar a 78 grados Celsius con un solo paso de tracción utilizando un peso de tracción de 182,2 gramos. Deja que el filamento se caliente, haciendo que la micropipeta de vidrio se separe en dos micropipetas con puntas afiladas debido a la gravedad.
Guarde las micropipetas de vidrio estirado en una placa de Petri cerrada de 100 milímetros y asegúrelas con cera o arcilla para evitar que se rompan las puntas afiladas. Para empezar, obtenga las micropipetas de vidrio estirado de las dimensiones deseadas. A continuación, prepare la mezcla maestra complementaria de síntesis de ADN y el tampón de lisis de tardígrados.
Tampón de lisis alícuota suficiente para extracciones con dos microlitros por tardígrado. Añadir inhibidor de la ribonucleasa al tampón de lisis para conseguir una concentración final de cuatro unidades por microlitro. Agite la solución brevemente, luego gírela en una centrífuga de mesa a 2000 g durante cinco segundos a temperatura ambiente.
Guarde la solución en hielo. Con una pipeta P1000 estéril con punta de filtro, extraiga el número necesario de tardígrados del cultivo y colóquelos en una placa de Petri estéril de 35 milímetros. Lave los tardígrados tres veces con un mililitro de agua de manantial estéril esterilizada en autoclave para eliminar los contaminantes de las algas.
Coloque la placa bajo un microscopio de disección con un aumento de 25X a 50X y use una pipeta P10 con punta de filtro para transferir un solo tardígrado a una nueva placa de Petri estéril de 35 milímetros. Ahora, con una pipeta P200 estéril con punta de filtro, lave el tardígrado individual en 100 microlitros de agua estéril sin nucleasas. Transfiera el tardígrado lavado a un tubo de PCR limpio y estéril en uno o dos microlitros de agua estéril sin nucleasas.
Visualice el tardígrado bajo un microscopio de disección con un aumento de 25X. Para facilitar la eliminación del agua, rompa ligeramente la punta de la micropipeta de vidrio extraído fuera del tubo. Utilizando la acción capilar de la micropipeta de vidrio, elimine el agua hasta que el tardígrado quede rodeado por una pequeña burbuja de agua.
Agregue dos microlitros de tampón de lisis tardígrado al tubo. Después de un vórtice breve, centrifugar el tubo a temperatura ambiente durante cinco segundos a 2000 g y almacenar la muestra en hielo. A continuación, coloque la muestra que contiene tardígrados en una gradilla de tubos de PCR y asegúrela firmemente.
Sujetando la gradilla con pinzas largas y gruesas, sumérjala suavemente en nitrógeno líquido hasta que la muestra esté completamente congelada. A continuación, retire la rejilla del nitrógeno líquido y colóquela sobre hielo. Descongele la muestra, monitoreándola cada 15 segundos hasta que se vuelva visiblemente transparente.
Después de repetir el proceso de congelación-descongelación cinco veces, coloque la muestra en hielo. Añadir dos microlitros de mezcla maestra de síntesis de ADN complementaria al tubo de PCR que contiene lisado de tardígrado. Agite brevemente el tubo y gírelo a 2000 g durante cinco segundos a temperatura ambiente y coloque la muestra en hielo.
Ahora, cargue la muestra en un termociclador e inicie el programa de síntesis de ADNc. Una vez completada la síntesis, coloque inmediatamente el tubo en hielo. Diluir la muestra hasta un volumen total de 25 microlitros con 21 microlitros de agua estéril sin nucleasas.
El protocolo optimizado logró triplicar el rendimiento de ADN complementario en comparación con los protocolos sin ciclos de congelación y descongelación, siendo seis ciclos óptimos. La extracción de ARN no tuvo éxito cuando había agua residual, lo que demuestra la necesidad crítica de eliminar el exceso de agua para una lisis consistente. El rendimiento de ARN fue de alrededor de 14,24 nanogramos por tardígrado.
Este protocolo fue más de 200 veces más eficiente que los kits de extracción de ARN en el rendimiento de la transcripción de actina, como lo demuestran los valores de Ct significativamente más bajos y la robusta amplificación de la banda de gel.
