우리는 극단적 완보동물인 Hypsibius exemplaris에서 신경 탄력성의 분자 메커니즘을 밝히는 데 중점을 두고 있습니다. 우리는 극한 환경에 노출된 후의 신경계 변화를 연구합니다. 우리는 완보동물이 극한의 환경을 경험한 후 신경해부학적 구조와 운동 기능에 대한 대규모 변화를 발견했습니다.
완보동물을 분자 생물학 연구를 위한 모델 유기체로 사용하는 것은 비교적 새로운 것입니다. 따라서, 완보동물에 적용하기 위해 아직 완전히 최적화되지 않은 많은 기술이 있습니다. 전사체학(transcriptomics), 단백질체학(proteomics) 및 형질전환(transgenesis) 분야에서 괄목할 만한 진전을 이루었지만, 여전히 개발되지 않은 표적 단백질의 검증 및 기능 평가에 필요한 방법과 도구가 있습니다.
단일 완보동물에서 RNA를 추출하기 위한 현재 프로토콜은 아직 qPCR에 적용되지 않았거나 추출을 위해 여러 동물이 필요합니다. 완보동물의 분자 신경생물학에 대한 연구를 계속하기 위해 개별 동물에서 유래한 RNA를 추출하고 정량화하여 첫째, RNA 염기서열분석 결과를 확인하고, 둘째, 개별 주입된 동물에서 RNAi 효율성을 평가하고, 셋째, 개체군 간 전사 변화의 개별 차이를 조사하는 방법이 필요했습니다. 우리의 방법은 세 가지 면에서 이전 기술을 개선합니다.
이전의 단일 완보동물 추출 방법에 비해 추출 시간을 약 30% 단축합니다. 또한 당사의 방법은 선형 PCR 증폭 단계의 필요성을 우회하므로 추출 비용을 100배 이상 절감합니다. 마지막으로, 우리의 방법은 종종 RNA의 상당한 손실을 초래하는 정제의 필요성을 우회하기 때문에 이전 방법보다 200배 더 효율적입니다.
우리의 연구 결과를 통해 완보동물 연구자들은 저비용의 효율적인 방식으로 개별 완보동물의 qRT-PCR을 통해 상대적 전사체 수준을 정량화할 수 있을 것입니다. 우리는 이것이 매우 정량적인 방식으로 RNAi 녹다운의 효율성을 정량화하고, 염기서열분석 히트를 확인하고, 다양한 동물에 걸친 전사 반응의 개인차를 탐색하는 데 사용되는 것을 보고 있습니다. 시작하려면 분젠 버너 또는 다른 제어된 화염원을 낮은 설정으로 켜십시오.
양손에 한쪽 끝이 있는 유리 마이크로피펫을 잡고 유리가 녹기 시작할 때까지 불꽃 위에 중심을 놓습니다. 부드러워지면 두 끝을 빠르게 당겨 두 개의 날카로운 팁을 만듭니다. 그런 다음 한 쌍의 멸균 된 미세 집게를 사용하여 마이크로 피펫의 끝을 가볍게 부러뜨려 선명도를 조정합니다.
유리 마이크로피펫을 마이크로피펫 풀러에 고정하여 가열 필라멘트와의 접촉을 피합니다. 최적화를 위한 시작점으로, 182.2g의 당김 무게를 사용하여 한 번의 당김 단계로 극점을 섭씨 78도로 설정합니다. 필라멘트를 가열하면 유리 마이크로피펫이 중력으로 인해 날카로운 점을 가진 두 개의 마이크로피펫으로 분리됩니다.
당겨진 유리 마이크로피펫을 밀폐된 100mm 페트리 접시에 보관하고 왁스나 점토로 고정하여 날카로운 팁이 깨지지 않도록 합니다. 시작하려면 원하는 치수의 당겨진 유리 마이크로피펫을 구하십시오. 그런 다음 상보적 DNA 합성 Master Mix와 완보성 용해 완충액을 준비합니다.
완보동물당 2마이크로리터를 사용하여 추출을 위한 충분한 용해 완충액을 분취합니다. 용해 완충액에 리보뉴클레아제 억제제를 첨가하여 마이크로리터당 4단위의 최종 농도를 달성합니다. 용액을 잠시 소용돌이친 다음 실온에서 2000g의 탁상용 원심 분리기에서 5초 동안 회전시킵니다.
용액을 얼음 위에 보관하십시오. 팁이 있는 멸균 필터 P1000 피펫을 사용하여 배양물에서 필요한 수의 완보동물을 제거하고 멸균 35mm 페트리 접시에 넣습니다. 완보동물을 1ml의 오토클레이브 멸균 샘물로 세 번 세척하여 조류 오염 물질을 제거합니다.
접시를 25X에서 50X 배율로 해부 현미경 아래에 놓고 필터 팁 P10 피펫을 사용하여 단일 완보동물을 새로운 멸균 35mm 페트리 접시로 옮깁니다. 이제 팁 형태의 멸균 필터 P200 피펫을 사용하여 100마이크로리터의 무균 뉴클레아제(nuclease-free) 물로 단일 완보동물을 세척합니다. 세척된 완보동물을 1-2마이크로리터의 무균 뉴클레아제의 깨끗한 멸균 PCR 튜브로 옮깁니다.
완보동물을 25X 배율로 해부 현미경으로 시각화합니다. 수분을 쉽게 제거하려면 당겨진 유리 마이크로피펫의 끝을 튜브 바깥쪽으로 가볍게 부수십시오. 유리 마이크로피펫의 모세관 작용을 사용하여 완보동물이 작은 물방울로 둘러쌀 때까지 물을 제거합니다.
2마이크로리터의 완보암 용해 완충액을 튜브에 추가합니다. 볼텍싱 후 실온에서 2000g으로 5초 동안 튜브를 잠시 원심분리하고 샘플을 얼음에 보관합니다. 그런 다음 완보동물이 포함된 샘플을 PCR 튜브 랙에 넣고 단단히 고정합니다.
길고 거친 집게로 랙을 잡고 샘플이 완전히 얼 때까지 액체 질소에 부드럽게 담그십시오. 그런 다음 액체 질소에서 랙을 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 샘플을 해동하고 눈에 띄게 투명해질 때까지 15초마다 모니터링합니다.
동결-해동 과정을 5회 반복한 후 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 2마이크로리터의 상보적 DNA 합성 Master Mix를 완보형 용해물이 포함된 PCR 튜브에 추가합니다. 튜브를 짧게 튕기고 실온에서 2000g으로 5초 동안 회전시킨 후 샘플을 얼음 위에 놓습니다.
이제, 샘플을 써모사이클러에 로드하고 cDNA 합성 프로그램을 시작합니다. 합성이 완료되면 즉시 튜브를 얼음 위에 올려 놓습니다. 샘플을 21마이크로리터의 멸균 뉴클레아제가 없는 물로 총 25마이크로리터로 희석합니다.
최적화된 프로토콜은 동결-해동 주기가 없는 프로토콜에 비해 상보적 DNA 수율이 3배 증가했으며, 6주기가 최적이었습니다. 잔류 수분이 존재할 때 RNA 추출이 실패했으며, 이는 지속적인 용해를 위해 과도한 수분을 제거해야 할 필요성이 매우 중요하다는 것을 보여줍니다. RNA 수율은 완보동물당 약 14.24나노그램이었습니다.
이 프로토콜은 현저히 낮은 Ct 값과 강력한 겔 띠 증폭으로 입증된 바와 같이 액틴 전사체 수율에서 RNA 추출 키트보다 200배 이상 효율적이었습니다.
