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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
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  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
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  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir präsentieren einen Fluoreszenz-Test, um zu zeigen, dass Lucifer Yellow (LY) ein robuster Marker ist, um die scheinbare parazelluläre Durchlässigkeit von hCMEC/D3-Zellmonolayern zu bestimmen, einem In-vitro-Modell der menschlichen Blut-Hirn-Schranke. Wir verwendeten diesen Assay, um die Kinetik einer konfluenten Monolayer-Formation in kultivierten hCMEC/D3-Zellen zu bestimmen.

Zusammenfassung

Die Blut- und Hirnschranke BBB besteht aus Endothelzellen, die eine Barriere zwischen dem systemischen Kreislauf und dem Gehirn bilden, um den Austausch von nicht essentiellen Ionen und toxischen Substanzen zu verhindern. Enge Knoten (TJ) versiegeln effektiv den parazellulären Raum in den Monolayern, was zu einer intakten Barriere führt. Diese Studie beschreibt einen LY-basierten Fluoreszenz-Assay, der zur Bestimmung seinesscheinbaren Permeabilitätskoeffizienten (P-App) verwendet werden kann und wiederum verwendet werden kann, um die Kinetik der Bildung von konfluenten Monolayern und die daraus resultierende enge Kreuzung zu bestimmen. Barriereintegrität in hCMEC/D3-Monolayern. Darüber hinaus zeigen wir einen zusätzlichen Nutzen dieses Assays, um die funktionelle Integrität von TJ in transfizierten Zellen zu bestimmen. Unsere Daten aus dem LY P App-Test zeigen, dass die hCMEC/D3-Zellen, die in einem Transwell-Setup gesät wurden, den LY-Parazelltransport effektiv auf 7 Tage nach der Kultur beschränken. Als zusätzlichen Nutzen des vorgestellten Tests zeigen wir auch, dass die DNA-Nanopartikeltransfektion den LY-Parazelltransport in hCMEC/D3-Monolayern nicht verändert.

Einleitung

Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist die Schutzbarriere, die den Zustrom von Plasmakomponenten in das Gehirngewebe begrenzt und besteht aus Hirn-Endothelzellen zusammen mit unterstützenden Zellen wie Pericyten. Die Hauptrolle von BBB ist es, als Barriere zu dienen, die den Raum zwischen peripherem Blut und zentralem Nervensystem (ZNS) versiegelt, um die Hämostase der neuronalen Mikroumgebung1,2zu erhalten. Die Hirnkapillaren-Endothelzellen versiegeln den parazellulären Weg effektiv durch Bildung interzellulärer enger Verbindungen (TJs)1. Diese Schutzbarriere ermöglicht glukose und ausgewählte Nährstoffe in das Gehirn zu gelangen, während es verhindert, dass die Mehrheit der Ionen, toxische Substanzen und Medikamente durch diese enge Barriere passieren. Neben ihrer Schützenrolle stellt die natürliche Barrierefunktion des BBB eine große Herausforderung bei der Entwicklung von Medikamentenabgabesystemen dar, die auf das ZNS abzielen.

In-vitro-Zellkulturmodelle der BBB sind hilfreiche Werkzeuge, um ihre Biologie zu studieren und die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung auf die Integrität der TJ-Barriere zu verstehen. Wir verwendeten die menschliche zerebrale mikrovaskuläre Endothelzelllinie (hCMEC/D3) als In-vitro-Modell, da es sich um ein akzeptiertes Modell des menschlichen Gehirnendothel3 handelt und viele Funktionen des menschlichen BBB rekapituliert. hCMEC/D3ist eine der am häufigsten verwendeten Zelllinien für die Modellierung der BBB in vitro4,5,6,7,8,9. Trotz ihrer vergleichsweise niedrigen Werte des transendotheliaalen elektrischen Widerstands (TEER), einem Maß für die Dichtheit der Barriere, behält diese Zelllinie die meisten morphologischen und funktionellen Eigenschaften von Hirnendothelzellen bei, selbst als Monokultur kokultivierte Gliazellen6,7. Die hCMEC/D3-Zelllinie drückt mehrere BBB-Marker einschließlich aktiver Transporter und Rezeptoren bis etwa Durchgang 35 aus, ohne eine Dedifferenzierung zu instabilen Phänotypen6,7,9 ,10,11. Das auffälligste Merkmal der hCMEC/D3-Zelllinie als In-vitro-BBB-Modell ist ihre Fähigkeit, TJs5,9,11,12zu bilden. Es sollte beachtet werden, dass, obwohl Stammzellen-abgeleitete BBB-Modelle in vielen Studien eine höhere Permeabilität zeigten als hCMEC/D3-Zelllinieund sie einige BBB-Marker ausdrücken, sie sich aber noch als das häufigste BBB-Zellmodell entwickeln 13 . Wichtig ist, dass stammzellenabgeleitete BBB-Modelle in Bezug auf maximale Durchgangszahlen gekennzeichnet werden müssen, die es den Zellen ermöglichen, stabile BBB-Phänotypen zu erhalten14.

Drei primäre Methoden werden häufig verwendet, um die Integrität der TJ-Barriere zu bestimmen,einschließlich der Messung von TEER, Messung des scheinbaren Permeabilitätskoeffizienten (P-App) von kleinen hydrophilen Tracermolekülen wie Saccharose, Inulin, Luzifergelb, usw. und Immunfärbung bekannter molekularer Marker von TJs wie claudin-5, ZO-1, occludin, etc.5. TEER ist eine relativ einfache und quantitative Methode, die den elektrischen Widerstand über die Zellmonolayer misst, die auf einem porösen Membransubstrat kultiviert sind5. TEER-Werte können jedoch durch experimentelle Variablen wie die Zusammensetzung des Kulturmediums und die Art des Messinstruments beeinflusst werden. Eine wahrscheinliche Kombination dieser Faktoren führt zu einer breiten Verteilung der TEER-Werte von 2 bis 1150 cm2 in der hCMEC/D3-Zelllinie, die für 2-21 Tage kultiviert wurde13. Immunostaining ist eine visuelle Methode, um das Vorhandensein von TJ-Proteinen zu bestimmen, indem das zielgerichtete Protein mit Antikörpern gekennzeichnet wird. Immunstaining beinhaltet jedoch eine Reihe von experimentellen Schritten, einschließlich der Notwendigkeit, Zellen zu fixieren/permeabilisieren, die zu experimentellen Artefakten führen können und die fluoreszierenden Signale können im Laufe der Zeit verblassen. Die oben genannten Faktoren können zu subjektiven Fehlern führen, die sich auf die Datenqualität auswirken.

Der Hauptfokus dieser Arbeit liegt auf der Präsentation eines LY-basierten scheinbaren Permeabilitäts-Assays, der die Kinetik einer konfluenten Monolayer-Formation in kultivierten hCMEC/D3-Zellen bestimmt. Obwohl andere fortschrittliche In-vitro-BBB-Systeme, wie Co-Kultursysteme, mikrofluidische Systeme, physiologisch relevantere Mimik mit deutlich verbesserter Barrierefunktion15,16,17, das hCMEC/D3 sind transwell Setup ist ein einfaches und zuverlässiges Modell, um die Kinetik der TJ-Bildung zu schätzen und schnell die Wirkung verschiedener Arzneimittelformulierungen auf die Barrierefunktion abzuschirmen. Im Allgemeinen sind die P-App-Werte für verschiedene hydrophile Solutes in hCMEC/D3-Monolayern konsistent. Beispielsweise sind die gemeldeten P-App-Werte für verschiedene niedermolekulare Massensolutes (z. B. Saccharose, Mannitol, LY, etc.) in verschiedenen In-vitro-BBB-Modellen in der Größenordnung von 10-4 cm/min5,18,19 , 20. In unserem Versuchsaufbau werden die Endothelzellen des Gehirns auf einer kollagenbeschichteten mikroporösen Membran zur Zellanhaftung und Monolayerbildung gesät, um die In-vivo-Barriere nachzuahmen. Es wird erwartet, dass die in der apikalen Seite hinzugefügte LY die interzellulären engen Knoten durchqueren und sich in der basolateralen Seite ansammeln. Größere Konzentrationen von LY in der basolateralen Seite deuten auf eine unreife, nicht voll funktionsfähige Barriere hin, während niedrigere Konzentrationen einen eingeschränkten Transport aufgrund des Vorhandenseins funktioneller TJs widerspiegeln, was zu einer ausgereiften Barriere führt.

LY ist ein hydrophiler Farbstoff mit ausgeprägten Anregungs-/Emissionsspitzen und vermeidet die Notwendigkeit, Tracermoleküle wie Saccharose, Mannitol oder Inulin radioaktiv zu beschriften. So können die Fluoreszenzwerte von LY verwendet werden, um seine parazelluläre Permeabilität über die BBB-Monolayer direkt zu berechnen. Im Vergleich zu vielen kommerziell erhältlichen Farbstoffen, die in biomedizinischen Bereichen verwendet werden, die unter kleinen Stokes-Schichten wie Fluorescein21leiden, beträgt die Stokes-Verschiebung von LY etwa 108 nm mit ausreichender spektraler Trennung, so dass LY-Fluoreszenzdaten als robustes Auslesen zur Bestimmung der parazellulären Durchlässigkeit. Wir verwendeten Western Blotting als orthogonale Technik, um Veränderungen in der Expression des engen Knotenmarkerproteins ZO-1 im Laufe der Kulturzeit zu demonstrieren. ZO-1-Expression, die über Western Blotting erkannt wird, wird verwendet, um die LY P-App-Daten zu ergänzen, und in Kombination deuten diese Daten darauf hin, dass die beobachteten Veränderungen der LY P-App-Werte die Bildung einer Monolayer mit allmählicher Ausdruck der engen Anschlussmarkierung ZO-1.

Wie bereits erwähnt, liegt der Schwerpunkt dieser Arbeit darin, einen LY-Assay als einfache Technik zur Überwachung der Bildung einer konfluenten Monoschicht mit funktionellen engen Knoten zu demonstrieren. Um jedoch einen zusätzlichen Nutzen des entwickelten Tests zu demonstrieren, haben wir die LY PApp in DNA-Nanopartikel-transfizierten hCMEC/D3-Monolayern gemessen. Nukleinsäuren können durch elektrostatische Wechselwirkung zwischen den positiv geladenen Polymergruppen und den negativ geladenen Phosphatgruppen von Nukleinsäuren 22 zu Polyelektrolyt-Nanopartikeln kondensiert werden22, 23. Wir bezeichnen diese Komplexe in unserer Arbeit als DNA-Nanopartikel (DNA-NPs). Während wir die Zelle transfetieren und das gewünschte Protein ausdrücken wollen, müssen wir sicherstellen, dass die Barriereeigenschaften der hCMEC/D3-Monolayer nicht beeinträchtigt werden. Unsere Daten deuten darauf hin, dass ein standard4 h luziferase Gentransfektionsregime die LY-Permeabilität nicht messbar verändert, die den Nutzen des LY P App-Assays demonstriert, um Veränderungen in der TJ-Barriereintegrität zu bestimmen.

Protokoll

1.Allgemeine hCMEC/D3 Zellkultur

  1. Reanimation von gefrorenen Zellen
    HINWEIS: Alle Zellkulturpflege- und Experimente wurden in einer sterilen Biosicherheitshaube durchgeführt. Kulturmedien, Nahrungsergänzungsmittel und Reagenzien wurden entweder als sterile Produkte gekauft oder über Filtration mit einem 0,22 m Membranfilter sterilisiert, um mikrobielle Kontaminationen zu verhindern.
    1. 8,5 ml Kollagenlösung (0,15mg/ml) in einen Gewebekulturkolben (75 cm2 Wachstumsbereich; fortan T75) geben und 1 h in einen Inkubator (37 °C, 5% CO2) geben.
    2. Entfernen Sie die Kollagenlösung und waschen Sie den Kolben vorsichtig mit sterilisierter Phosphat-gepufferter Saline (PBS). 15 ml komplettes Wachstumsmedium in den Kolben geben und 15 min im CO2-Inkubator abgeben.
      ANMERKUNG: Das komplette Medium (Endkonzentration) enthielt Endothelzellwachstum Basal Medium-2 (500 ml), ergänzt durch fetales Rinderserum (5%), Penicillin-Streptomycin (1%), Hydrocortison (1,4 m), säureascorbunter (5 g/ml), chemisch definiertes Lipid (1/100), HEPES (10 mM) und Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (1 ng/ml).
    3. Bewegen Sie eine Kryovial von gefrorenen hCMEC/D3-Zellen aus dem flüssigen Stickstofftank und tauen Sie die Durchstechflasche schnell in einem 37 °C-Wasserbad auf (< 1 min).
    4. Sobald nur noch eine winzige Eisflocke sichtbar ist, saugen Sie die Zellen schnell an und übertragen Sie sie in den Kolben, der vorgewärmtes Medium enthält. Schütteln Sie den Kolben vorsichtig, um eine Vermischung der Zellen mit dem Wachstumsmedium zu ermöglichen.
    5. Legen Sie den Kolben in den Inkubator (37 °C, 5%CO2) und beobachten Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop nach 2 h, um sicherzustellen, dass die Zellen befestigt sind.
    6. Sobald die Zellen an der Unterseite des Kolbens befestigen, entfernen Sie das alte Wachstumsmedium und fügen Sie 10 ml frisches vorgewärmtes Wachstumsmedium hinzu, um Dimethylsulfoxid im alten Wachstumsmedium24zu ersetzen.
    7. Nach 24 h unter einem Lichtmikroskop auf spindelförmige Zellen überprüfen und das alte Wachstumsmedium durch vorgewärmtes frisches Wachstumsmedium ersetzen.
  2. Zellkulturpflege
    1. Füllen Sie das Wachstumsmedium jeden zweiten Tag bis zu 100% Zusammenfluss auf. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, bevor Sie das alte Wachstumsmedium entfernen und auch nach Zugabe von frischem Wachstumsmedium. Nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und untersuchen Sie hCMEC/D3-Zellen unter Phasenkontrastmikroskop, um sicherzustellen, dass sie gesund erscheinen.
      HINWEIS: Die meisten Zellen sollten an der Unterseite des Kolbens befestigt werden, haben eine spindelförmige Morphologie und oft wird auch Licht um ihre Membranen brechen. Wachstumsmedium sollte transparent (nicht bewölkt) und rosa-orange in der Farbe sein.
    2. Altes Wachstumsmedium aus dem Kolben nehmen und 10 ml vorgewärmtes frisches Medium in den Kolben übertragen.
      HINWEIS: Das Medium sollte auf der Oberseite des Kolbens und nicht direkt auf der Oberfläche der Zellen hinzugefügt werden, um die Zellbindung zu vermeiden.
    3. Drehen Sie den Kolben wieder in horizontale Position und schaukeln Sie ihn mehrmals sanft und überprüfen Sie hCMEC/D3-Zellen unter dem Mikroskop, bevor Sie den Kolben zum Inkubator zurückgeben (37 °C, 5% CO2).
    4. Beobachten Sie die Zellen unter einem invertierten Lichtmikroskop jedes Mal vor und nach der Handhabung der Zellen, sowohl während der regulären Kulturarbeit als auch während der Experimente. Zeichnen Sie alle spürbaren Änderungen in der Zellzahl oder Morphologie im Labor-Notebook auf.
  3. Zellpassaging
    1. Inkubieren Sie einen neuen T75-Kolben mit 8,5 ml Kollagenlösung für 1 h im Inkubator (37 °C, 5% CO2).
    2. Entfernen Sie die Kollagenlösung und waschen Sie den Kolben vorsichtig mit sterilisiertem PBS. 10 ml vorgewärmtes hCMEC/D3-Medium in den neuen Kolben geben und den Kolben in den Inkubator legen (37 °C, 5% CO2).
    3. Nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und untersuchen Sie hCMEC/D3-Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop, um zu überprüfen, ob die Zellen zu 100% konfluent sind.
    4. HCMEC/D3-Zellmedium aus dem Kolben entfernen, der Zellen enthält, und hCMEC/D3-Zellen mit 10 ml PBS waschen.
      HINWEIS: FBS, das dem Wachstumsmedium zugesetzt wird, enthält Protease-Inhibitoren wie z. B. Antitrypsin und 2-Macroglobulin. Diese hemmen den Trypsinisierungsprozess. Daher ist es wichtig, die Zellen mit PBS zu waschen, um Spuren von FBS zu entfernen, um die Hemmung des Trypsinisierungsprozesses zu verhindern.
    5. Fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin-Lösung mit 0,02% EDTA hinzu und versuchen Sie 2-5 min imInkubator (37 °C, 5% CO2 ) (tippen Sie vorsichtig auf den Kolben an den Seiten, um die Ablösung zu unterstützen).
      HINWEIS: Lassen Sie die Zellen niemals mehr als 6 min auf Trypsin/EDTA.
    6. Fügen Sie 10 ml vorgewärmtes hCMEC/D3-Medium hinzu, um den Trypsinisierungsprozess zu stoppen und die hCMEC/D3-Zelle durch mehrmalses Pipetieren nach oben und unten wieder aufzuhängen. Entfernen Sie dann die gesamte Zellsuspension aus dem Kolben in ein 15 ml-Rohr.
    7. 1 ml der Zellsuspension aus dem 15 ml Rohr auf den neuen Kolben mit vorgewärmten frischen Medien (Spaltenzellen 1:10) übertragen und den neuen Kolben zurück zum Inkubator zurückgeben.
      HINWEIS: Bevor Sie auf den neuen Kolben übertragen, pipette die Zellsuspension mehrmals nach oben und unten, um Zellkonzentrationsgradienten zu minimieren.

2. Zellbeschichtung

  1. Gewebekultureinsätze mit mikroporösen Membranen (Porengröße: 0,4 m, Material: Polyethylenterephthalat (PET)) in eine 24-Well-Kulturplatte geben.
  2. Fügen Sie 400 l Kollagen Typ I (0,15 mg/ml) in jede Gewebekulturbeilage und inkubieren Sie für 1 h im CO2-Inkubator (37 °C, 5% CO2). Rocken Sie die 24-Well-Platte sanft, um eine gleichmäßige Ausbreitung der Kollagenlösung über die mikroporöse Membran in den Gewebekultureinsätzen zu ermöglichen.
  3. Entfernen Sie die Kollagenlösung und waschen Sie die mikroporöse Membran vorsichtig mit 0,4 ml 1x 1x PBS Puffer.
  4. Platte hCMEC/D3-Zellen mit einer Dichte von 50.000 Zellen/cm2 in den Zelleinsätzen (15.000 Zellen in 500 l Medium).
    HINWEIS: Um die Unterschiede in der Zellzahl in jedem Gewebekultureinsatz zu minimieren, wurde die Zellsuspension mit einer 10 ml Pipette resuspendiert, bevor zellen zu den Einsätzen hinzugefügt wurde.
  5. Legen Sie die 24-Well-Platte mit Gewebekultur-Setup in einen Inkubator (37 °C, 5% CO2), um Zellanhaftung und Proliferation zu ermöglichen.
  6. Inkubieren Sie die Platte für 7 Tage, damit die Zellen 100% Konfluenz erreichen können. Entfernen Sie das Wachstumsmedium jeden zweiten Tag und übertragen Sie 0,5 ml vorgewärmte Frischmedien in Gewebekultureinsätze.
  7. Wiederholen Sie den Beschichtungsvorgang (Schritte 2.2-2.6) auf einer 12-Well-Platte, einer 48-Well-Platte und einer 96-Well-Platte. Verwenden Sie die 12-Well-Platte für Western Blotting, um Änderungen im ZO-1-Ausdruck zu bestimmen. Verwenden Sie die 48-Well-Platte für die DNA-NP-Transfektion. Verwenden Sie die 96-Well-Platte für den ATP-Assay, um die Zelllebensfähigkeit in transfizierten Zellen zu bestimmen.

3. Kinetik des Zellwachstums.

  1. Samen Sie die Zellen mit einer Dichte von 50.000 Zellen/cm2 in einer kollagenbeschichteten 24-Well-Gewebekulturplatte.
  2. Entfernen Sie an jedem Tag des Experiments das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 500 l 1x PBS. Dann fügen Sie 30 l 0,25% Trypsin-Lösung mit 0,02% EDTA hinzu und lassen Sie die Platte ca. 2-5 min in einem Inkubator (37 °C, 5% CO2).
    ANMERKUNG: Die allmähliche Bildung der konfluenten Monoschicht kann das Ausmaß der Zellablösung beeinflussen, und es ist notwendig, die Mengen von Trypsin/EDTA, wie hier angegeben, zu erhöhen: 30 L für 1-5 Tage nach der Aussaat, 60 l für 6-7 Tage nach der Aussaat und 100 L für 8-10 Tage nach der Aussaat .
  3. Fügen Sie entweder 470 l, 440 l oder 400 L Wachstumsmedium auf der Grundlage des Volumens der Trypsin/EDTA-Lösung hinzu, die im Schritt 3.2 hinzugefügt wurde, um 500 l Zellsuspension in jedem Bohrkörper vorzubereiten.
  4. Suspendieren Sie die Zellen, indem Sie in jedem Brunnen mehrmals nach oben und unten pfeifen, und beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass alle Zellen im Wachstumsmedium suspendiert sind. Wenn einige Zellen nach dem Pipetieren noch mehrmals am Plattenboden befestigt sind, kratzen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Kunststoffzellenschaber, um die Zellablösung zu erleichtern.
  5. Entfernen Sie 0,1 ml Zellsuspension von 500 l Zellsuspension in Schritt 3.3 und fügen Sie zu einem 1,5 ml Rohr hinzu. Dann 0,1 ml 0,4% Trypan-Blaulösung in die Zellsuspension geben und gut mischen.
  6. Reinigen Sie ein Hemacytometer mit 70% Isopropylalkohol. Fügen Sie 20 l Mischung aus Schritt 3,5 auf jeder Seite in der V-Nut hinzu und lokalisieren Sie die 16 Quadrate unter dem Mikroskop. Die 16 Quadrate werden als ein Raster betrachtet. Suchen Sie zwei zufällige Gitter auf jeder Seite des Hemacytometers und zählen Sie alle lebenden, nicht blauen Zellen.
    HINWEIS: Zellen, die blau in der Farbe von der Zählung ausgeschlossen erschienen, <1% der Zellen blau zu allen Zeitpunkten gebeizt.
  7. Berechnen Sie die Zelldichte (Zellen/cm2) basierend auf folgenden Formeln.
    Durchschnitt der Zellen/Raster figure-protocol-9839 = (Eq.1)
    Verdünnungsfaktor= figure-protocol-9936 (Eq.2)
    Zelldichte (lebensfähige Zellen/cm2) =
    figure-protocol-10087
    (Eq.3)
    Gleichungen 1-3. Lebensfähige Zellen sind die Anzahl der Zellen in jedem Raster gezählt, Anzahl der Gitter entsprechen der Anzahl der Gitter unter dem Mikroskop, Volumen der Mischung von Zellsuspension und 0,4% Trypan blau ist das Volumen in Schritt 3.5 vorbereitet, Volumen der Zellsuspension entfernt wird das Volumen von 500 l Zellsuspension in Schritt 3.5 entfernt, das Volumen der Zellsuspension in jedem Brunnen ist die 500 l Zellsuspension aus Schritt 3.3, Wachstumsbereich der Gewebekulturplatte ist der Wachstumsbereich von Einzelbrunnen in 24-Well-Platte.

4. Luzifer gelb scheinbare Durchlässigkeit (LY P App ) Assay

  1. Um die LYP-App an jedem Tag nach dem Seeding zu bestimmen, führen Sie die Schritte ab 4.3 aus. Zur Bestimmung der P-App in transfizierten hCMEC/D3-Zellen fügen Sie 8,3 l der Transfektionsformulierung (Abbildung 1) mit 50 l vollständigem Wachstumsmedium und Inkubation für 4 h vermischt hinzu. Transfektionsformulierungen sind in Abschnitt 5 beschrieben.
  2. Waschen Sie nach der 4 h-Transfektion die apikale Seite vorsichtig zweimal mit einem sterilen 1x PBS-Puffer, um restliche Transfektionsmischungen zu entfernen. Unterschiedliche Volumina des PBS-Puffers, die nach der Entfernung zurückbleiben, können die Konzentration von LY auf der apikalen Seite beeinflussen. Achten Sie darauf, dass der verbleibende PBS-Puffer in Gewebekultureinsätzen vollständig entfernt wird. Saugen Sie sorgfältig Restreagenzien und Medium, um die Zellablösung zu minimieren.
    HINWEIS: Dieser Schritt wird bei der Messung der alltäglichenscheinbaren Durchlässigkeit (P-App ) von hCMEC/D3-Zellen übersprungen.
  3. Entfernen Sie das Wachstumsmedium und fügen Sie 1,5 ml vorgewärmten (37 °C) Transportpuffer (25 mM HEPES, 145 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 1 mM NaH2PO4, 5 mM Glukose, pH 7,4) zur basolateralen Seite hinzu.
    ANMERKUNG: Das Volumen des Transportpuffers in allen basolateralen Kompartimenten sollte gleich sein, um die Genauigkeit der Berechnung des Permeabilitätskoeffizienten zu gewährleisten.
  4. Fügen Sie der apikalen Seite jedes Transwell-Einsatzes 58,3 L von 20 -M LY-Lösung hinzu. Sparen Sie 50 l der 20-Mm-LY-Lösung für Fluoreszenzmessungen. Nachdem Sie den Rest-PBS-Puffer vollständig von der apikalen Seite entfernt haben, fügen Sie die LY-Lösung so schnell wie möglich hinzu, um das Trocknen von hCMEC/D3-Zellen zu vermeiden. Stellen Sie genaue Volumina der LY-Lösung auf der apikalen Seite sicher.
    HINWEIS: Um den Zerfall der LY-Fluoreszenzintensität zu minimieren, sollte die Lichtexposition begrenzt sein. Nach der Rekonstituierung des LY-Pulvers sollte die Lösung bei 4 °C gelagert werden, geschützt vor Licht.
  5. Inkubieren Sie in einem Drehplatten-Shaker (37 °C, 100 Rpm) für 60 min. Entfernen Sie dann 30 l der LY-Probe aus jedem apikalen Fach. Dann die 20-M-LY-Lösung und die apikalen Seitenproben in vorbeschriftete Rohre übertragen und die Probe mit einem Transportpuffer 10-fach verdünnen.
    HINWEIS: Es ist erforderlich, die 20-M-LY-Stammlösung und die apikalen Seitenproben zu verdünnen, da die hohe Fluoreszenzintensität dieser Proben den Fluoreszenzdetektor des Fluoreszenz-Mikroplattenlesers potenziell überlasten und beschädigen kann.
  6. Entfernen Sie 500 l aus jedem basolateralen Fach und übertragen Sie die Probe in vorbeschriftete Rohre.
    HINWEIS: Proben werden zu angegebenen Zeitpunkten aus einem separaten Transwell entfernt. Die Zeitpunkte sind jeden Tag nach der Aussaat ab Tag 1 bis Tag 10.
  7. Bereiten Sie eine Reihe von LY-Standards für die Standardkurve vor (39,00 nM, 78,13 nM, 156,25 nM, 312 nM, 625 nM, 1250 nM, 2500 nM).
  8. Fügen Sie jedem Bohrwert in einer schwarzen 96-Well-Platte 100 l jeder Standard-, apikalen und basolateralen Probe hinzu (Abbildung1).
    HINWEIS: Schwarze Platten absorbieren Licht und reduzieren Hintergrund- und Fluoreszenz-Crossover zwischen Brunnen.
  9. Verwenden Sie einen Fluoreszenz-Mikroplattenleser (Sollwerte: Anregung 428 nm, Emission 536 nm), um die LY-Fluoreszenzintensität zu messen, um dieP-Appzu berechnen. Für diese Studie wird ein Fluoreszenzplattenleser verwendet.
  10. Berechnen Sie die P-App- und %LY-Wiederherstellungswerte, wie im Manuskripttext beschrieben.
    Gleichung 4. Formeln für die Berechnung von P-App-Werten.
    Berechnen Sie den koeffizientenKoeffizienten der scheinbaren Durchlässigkeit (P-App) und die %LY-Wiederherstellung anhand der folgenden Gleichungen. Es sollte beachtet werden, dass die P-App-Werte entweder auf der Grundlage von Masse25 oder der Konzentration von LY berechnet werden können.
    figure-protocol-15113 oderfigure-protocol-15201
    VA - Volumen im apikalen Fach
    VB - Volumen im basolateralen Fach
    A - die Oberfläche der Transwell-Insert-Membran (0,3 cm2)
    MA0 - die Anfangsmasse im apikalen Fach
    MB/t - die Veränderung der Masse im Zeitverlauf im basolateralen Fach
    CA0 - die Anfangskonzentration im apikalen Fach
    CB/t - die Veränderung der Konzentration im Zeitverlauf im basolateralen Fach.
    Gleichung 5. Formeln für die Berechnung von % LY-Wiederherstellung.
    Erholung (%) = figure-protocol-15838
    MAf ist die Masse im apikalen Fach am Endzeitpunkt, MBf ist die Masse im basolateralen Fach am Endzeitpunkt, MA0 ist die Anfangsmasse im apikalen Fach. 26 Hinweis: Die Anfangsmasse wird auf der Grundlage des Volumens der 20-M-LY-Lösung im Schritt 4.5 berechnet. Dieses Experiment wurde immer mit Zellen unter Durchgangsnummer 35 durchgeführt und wurde viermal unabhängig durchgeführt.

5. Kalziummangel

  1. Entfernen Sie das Wachstumsmedium aus den Transwell-Einsätzen und der 12-Well-Platte und waschen Sie die apikale Seite und die 12-Well-Platte vorsichtig mit vorgewärmtem calciumfreiem Medium (Minimum Essential Medium Eagle Spinner (S-MEM) medium), um Calciumionen aus den Transwell-Einsätzen zu entfernen und 12-Well-Platte.
  2. 500 l oder 2 ml vorgewärmtes S-MEM 1xmedium zu den Einsätzen oder 12-Well-Platten geben und 24 h im Inkubator brüten (37 °C, 5% CO2). Nach der Inkubation das 1x-Medium S-MEM entfernen und die Zellen einmal mit vorgewärmten 1x PBS-Puffer waschen.
  3. Befolgen Sie die schritte 4.4-4.10, die in Abschnitt 4 für die LY-Behandlung und die nachfolgenden Schritte beschrieben sind. Führen Sie die Schritte 8.1.2-8.2.4 aus, die in Abschnitt 8 für Western Blotting und nachfolgende Schritte beschrieben sind.

6. Transfektion

  1. Herstellung von DNA-Nanopartikeln (DNA-NPs).
    1. Verdünnen Sie die Stammlösung von gWIZ-Luc Plasmid in 10 mM Natriumacetat (NaAc) Puffer (pH 5.0) und lassen Sie die DNA-Lösung für 10 min bei Raumtemperatur (RT) stehen.
      HINWEIS: Die DNA NP, die überwiegend einzelne DNA-Moleküle enthält, kann in DNA-Konzentrationen von 20-40 g/ml23hergestellt werden. Daher muss die gWIZ-Luc Plasmid-Stammlösung verdünnt werden. Der gefrorene gWIZ-Luc Plasmidbestand muss komplett auf Eis aufgetaut werden, um Temperaturstress zu minimieren. Wirbeln Sie die verdünnte DNA-Lagerlösung für 30 s auf einem Standard-Benchtop-Wirbeltexer auf Knopfposition 3-5 sanft.
    2. Berechnen Sie die gewünschten N/P-Verhältnisse, die hier als numerischer Parameter verwendet werden, um die NP-Zusammensetzung widerzuspiegeln.
      figure-protocol-18214
      Gleichung 6. N/P-VerhältnisBerechnung: das Verhältnis der Maulwürfe der Amingruppen kationischer Polymere zu dem der Phosphatgruppen der DNA. Masse der kationischen Polymere: Gesamtgewwägete Menge kationischer Polymere; (Masse/Ladung) kationische Polymere bezieht sich auf das Molekulargewicht von kationischem Polymer (Poly (Ethylenglycol)5k-Block-Polyaspartamid mit 48 Diethylenetiamin-Seitenketten (PEG-DET)), normalisiert auf die Anzahl der geladenen Primäramine (48) pro kationisches Polymer ( mol/mol), ist dieser Wert für unser Polymer 306 Da; Dna-Masse bezeichnet die Gesamtmenge der DNA, die in der Formulierung verwendet wird, die durch Multiplikation des Volumens und der Konzentration in mg/ml gewonnen wird; (Masse/Ladung) DNA bezieht sich auf das Molekulargewicht der DNA normalisiert auf Anzahl der Phosphatgruppe pro doppelsträngige DNA (325 Da pro Nukleobase).
      HINWEIS: Die DNA NP-Vorbereitungstabelle (Tabelle 1) enthält das Rezept für die verschiedenen Proben, die in unseren Experimenten getestet wurden. DNA NP wurden mit einer schnellen Titrationstechnik hergestellt. Die PEG-DET Polymerlösung wurde entlang der Rohrwände hinzugefügt, während das Rohr in einer horizontalen Position gehalten wurde. Dann wurde das Rohr in eine vertikale Position geschaltet, gefolgt von einem schnellen Wirbel bei maximaler Geschwindigkeit für 10s. Die DNA NP durfte vor der Anwendung 30 min bei RT stehen. Die Faustregel für die DNA-NP-Dosierung beträgt 0,5 g DNA für ca. 1 cm2 Wachstumsfläche. So bereiten Sie für jeden Transwell-Einsatz/jeden Brunnen in einer 48-Well-Platte/jeder Bohrung in einer 96-Well-Platte DNA-NP bei N/P 10 vor, die 0,157/0,5/0,195 g/Well von gWIZ-Luc DNA enthält.
    3. Für Proben mit einer angegebenen Konzentration von Poloxamer P84 (P84) fügen Sie P84 zu DNA NP und Wirbel für 5 s hinzu. Die Endkonzentration von P84 in jeder Probe beträgt entweder 0,01 % oder 0,03 % wt.
  2. DNA-NP-Transfektion in einem 48-Well-Platten-Setup
    1. Säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 50.000 Zellen/cm2 in einer 48-Well-Platte und wachsen Sie bis zum Zusammenfluss im Inkubator (37 °C, 5% CO2 ).
    2. Mischen Sie für jede Behandlungsgruppe 25 l der angegebenen Probe (Transfektionsformulierung) und 150 l des gesamten Wachstumsmediums und 175 l dieser Mischung zu jedem Brunnen.
    3. Beobachten Sie die hCMEC/D3-Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen zum Zeitpunkt des Experiments gesund und zu 100 % konfluent erscheinen.
    4. Entfernen Sie das Wachstumsmedium aus Brunnen und 175 L Transfektionsmischung zu jedem Brunnen. Dann inkubieren Sie die Platte für 4 h im Inkubator (37 °C, 5% CO2).
    5. Nach 4 h das Transfektionsgemisch entfernen und die hCMEC/D3-Zellen mit vorgewärmten sterilen 1x PBS-Puffer waschen.
      HINWEIS: Um die versehentliche Ablösung von hCMEC/D3-Zellen von der Platten-/Einfügefläche während der Waschschritte zu minimieren, pipetten Sie sorgfältig ausreichend sterile PBS entlang der Wände der Brunnen und entfernen Sie alle Nanopartikel in den Restkulturmedien.
    6. Die Platte ein paar Mal vorsichtig schaukeln und vorsichtig ansaugen und entsorgen Sie die PBS-Waschanlage und fügen Sie 500 L hCMEC/D3 vorgewärmtes Kulturmedium hinzu.
    7. Mikroskopisch untersuchen Sie die Zellen und zeichnen Beobachtungen auf Zellmorphologie und mögliche Auswirkungen der Transfektion auf.
    8. 24 h im 37 °C Zellkultur-Inkubator inkubieren, um die Luziferase-Produktion zu ermöglichen. Nach 24 h das Wachstumsmedium vollständig entfernen und die Zellen einmal mit vorgewärmtem 1x PBS waschen.
    9. Lyse die transfizierten Zellen durch Zugabe von 100 l eiskalte Luziferase-Zellkultur Lyse 1x Reagenz pro Brunnen.
    10. Zur Messung des Luciferase-Proteingehalts 20 l Zelllysat und 100 l Luziferase-Assay-Puffer (20 mM Glycylglycin (pH 8), 1 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 3,5 mM DTT, 0,5 mM ATP, 0,27 mM Coenzym A) in ein 1,5 ml-Rohr geben.
    11. Lesen Sie die Lumineszenz der Probe, die im Schritt 6.2.10 auf einem Luminometer mit einem einzigen Auto-Injektor beschrieben wird.
      HINWEIS: Die Lumineszenz sollte vor dem Lesen über 10 s integriert werden.
    12. Messen Sie die Gesamtmenge des zellulären Proteins im Lysat mit einem Bicinchoninsäure-Assay(BCA-Assay)-Kit, indem Sie dem Herstellerprotokoll folgen.
    13. Berechnen und exprimieren Sie die Luziferase-Genexpression als Relative Light Units (RLU) pro gesamtem zellulären Protein.

7. Lumineszierender ATP-Assay

  1. Säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 50.000 Zellen/cm2 in einer 96-Well-Platte und wachsen Sie bis zum Zusammenfluss im Inkubator (37 °C, 5% CO2 ).
  2. Transfekte die Zellen mit 9,7 l der Transfektionsformulierung (Vorbereitungsdetails sind in Abschnitt 6) und 58,4 l des gesamten Wachstumsmediums für 4 h.
  3. Entfernen Sie das Transfektionsgemisch und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit vorgewärmten PBS 1x Puffer zweimal, um die Behandlungsreagenzien vollständig zu entfernen.
    HINWEIS: Verschiedene Mengen des Restpuffers könnten die ATP-Assay-Reagenzien in unterschiedlichem Ausmaß verdünnen und die Daten potenziell beeinflussen.
  4. Mischen Sie 75 l frisches vorgewärmtes Medium und ATP-Assay-Reagenz in einer 1:1-Verdünnung mit einer Mehrkanalpipette. Stellen Sie sicher, dass der Flüssigkeitsstand in allen Mehrkanal-Pipettenspitzen gleich ist.
  5. Legen Sie die Platte 15 min bei Raumtemperatur auf einen nussigen Shaker. Nach 15 min Zugabe der Reagenzien 60 l jeder Probe in eine weiße 96-Well-Platte geben.
    HINWEIS: Weiße Platten sind besser, Ausgangslicht als klare oder schwarze Platten zu reflektieren.
  6. Pop alle Luftblasen mit einer Nadel vor dem Lesen der Platte. Lesen Sie die Platte auf einem Luminometer mit einer Integrationszeit von 1 s. Lesen Sie die Platte innerhalb von 20 min nach Zugabe von ATP-Assay-Reagenzien. Timing ist entscheidend für den Vergleich zwischen verschiedenen Platten, da das Lumineszenzsignal mit einer schnellen Zerfallsrate transient ist.
  7. Berechnen Sie den Prozentsatz (%) Zelllebensfähigkeit nach dieser Formel: (Lumineszenz transfizierter Zellen/Lumineszenz der Kontrolle, unbehandelte Zellen) x 100.

8. Western Blotting zur Messung des engen Knotenproteins ZO-1

  1. Zelllyse und Proteinextraktion
    HINWEIS: Alle Schritte zur Proteinextraktion aus Zellen müssen bei 2-8 °C durchgeführt werden.
    1. Samen Sie die Zellen mit einer Dichte von 50.000 Zellen/cm2 in einer kollagenbeschichteten 12-Well-Gewebekulturplatte.
    2. An Tag 3, Tag 5, Tag 7, Tag 10 nach der Aussaat und an Tag 7 (Zellen mit kalziumfreiem Medium vorbebrütet), entfernen Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal mit 2 ml eiskaltem 1x PBS. Dann fügen Sie 300 l Mischung aus eiskaltem 1x RIPA-Lysepuffer, der 3 g/ml Aprotinin in jedem Brunnen enthält.
      HINWEIS: Die Mischung sollte frisch hergestellt und auf Eis gehalten werden. Aprotinin wird verwendet, um proteasen, die in Lysaten vorhanden sind, daran zu hindern, das Protein von Interesse zu degradieren.
    3. Nach zwei Gefrierzyklen (-80 °C) kratzen Sie die Zellen mit einem kalten Kunststoffzellenschaber. Sammeln Sie die Zelllysate in Mikrofugenröhren. Zentrifugieren Sie dann die Rohre bei 200 x g für 30 min bei 4 °C.
    4. Sammeln Sie den Überstand in saubere Rohre und legen Sie sie auf Eis. Messen Sie die Gesamtmenge des zellulären Proteins in den Lysaten mit dem BCA-Assay-Kit, indem Sie dem Herstellerprotokoll folgen.
  2. Western Blotting zum Nachweis von engen Knotenprotein ZO-1
    1. Denaturierende Aliquoten der Gesamthomogenate mit einem Gesamtprotein gehaltiumieren 40 g mit 1x Laemmli-Puffer bei 95 °C, 5 min und elektrophorese mittels Elektrophorese in einem reduzierenden 6-7,5% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel (SDS-PAGE) (90 V, 10 min durch Stapelgel, 120 V durch Gele lösen).
      HINWEIS: Denken Sie beim Laden der Proben oder Standards daran, langsam und vorsichtig in jede Spur zu laden, wobei Sie darauf achten, den Brunnen dabei nicht zu brechen.
    2. Übertragen Sie die abgetrennten Proteine auf eine Nitrocellulosemembran mit pH 8,5 Transferpuffer, der 192 mM Glycin, 25 mM Tris Base, 10% Methanol und 0,1% SDS (75 V, 110 min bei Raumtemperatur) enthält.
      HINWEIS: Berühren Sie die Membran nicht. Verwenden Sie 70% Isopropanol-gewaschene Kunststoffzange, um die Membran zu handhaben. Um das ZO-1-Protein (MW 200 kDa) erfolgreich auf die Membran zu übertragen, sollte der pH-Wert bei 8,3-8,5 betragen. Wenn der Transferpuffer saurer ist, würde eine Übertragung nicht stattfinden. Wenn die Leiterbänder noch auf dem Gel sichtbar sind, wäre es hilfreich, die Transferzeit und die SDS-Konzentration zu erhöhen.
    3. Nach dem Waschen der Membran mit Tris-gepufferter Salin, die 0,1%Tween 20 (T-TBS) enthält, verwenden Sie die Blockierlösung (1:1 LiCOR-Odyssey Block: 1x Tris gepufferte Saline), um die Membranen für 60 min zu blockieren.
    4. Schneiden Sie die Membran vorsichtig in zwei Streifen. Inkubieren Sie mit zwei primären Antikörpern (ZO-1 monoklonaler Antikörper, Verdünnung, 1: 900, und Glyceraldehyd 3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) Antikörper, Verdünnung, 1: 10.000) über Nacht bei 4 °C. Dann inkubieren Sie die ZO-1- und GAPDH-Membranen mit Esel-Anti-Maus-IgG (Verdünnung, 1:50.000). Nach dem Waschen der Membranen mit T-TBS, stellen Sie die Membranen im 700-Kanal auf einem 16-Bit-Imager ab.

Ergebnisse

Zuerst haben wir den Effekt der Kultivierungszeit auf die LY-Permeabilität bestimmt, um die scheinbare Kinetik der TJ-Bildung zu bestimmen. Die durchschnittlichen LY P-App-Werte vom Tag 1 bis 10-Post-Seeding sind in Abbildung 2adargestellt. Am ersten Tag betrug die durchschnittlicheP-App 4,25 x 10-4 cm/min und fiel am 2. Tag leicht auf 3,32 x 10-4 cm/min. Der mittlere P-App-Wert stieg am 3. Tag leicht au...

Diskussion

Eine Schlüsselrolle des BBB besteht darin, den Austausch von nicht essentiellen Ionen und toxischen Substanzen zwischen der systemischen Zirkulation und dem Gehirn zu verhindern, um die Hämostase der neuronalen Mikroumgebung aufrechtzuerhalten. Eines der charakteristischen Merkmale des BBB ist die Fähigkeit der Kapillaren-Endothelzellen, enge Knoten (TJs) zu bilden, die den parazellulären Transportweg effektiv versiegeln. Wir demonstrierten einen LY P App-Assay als quantitative Methode zur Bestimmung der s...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Autoren sind dankbar für die finanzielle Unterstützung durch den New Investigator Award 2017 der American Association of Pharmacy, einen Hunkele Dreaded Disease Award der Duquesne University und die School of Pharmacy Start-up-Fonds für das Manickam-Labor. Wir möchten dem Leak-Labor (Duquesne University) für die Unterstützung durch western Blotting danken und die Verwendung ihres Odyssey 16-Bit-Imagers ermöglichen. Wir möchten auch eine besondere Dankesnote für Kandarp Dave (Manickam Labor) für die Hilfe bei western blotting.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
hCMEC/D3 cell lineCedarlane Laboratories102114.3C-P25human cerebral microvascular endothelial cell line 
gWizLucAldevron 5000-5001Plasmid DNA encoding luciferase gene
lucifer yellow CH dilithium salt Invitrogen155267
Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranesFalcon353095
Tissue culture flask Olympus Plastics25-207
24-well Flat Bottom Olympus Plastics25-107
Black 96-Well Immuno Plates Thermo Scientific437111
S-MEM 1XGibco1951695Spinner-minimum essential medium (S-MEM)
EBM-2CloneticsCC-3156Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) 
phosphate-buffered saline 1XHyCloneSH3025601
Collagen Type I Discovery Labware, Inc.354236
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific23227
Cell Culture Lysis 5X Reagent PromegaE1531
Beetle Luciferin, Potassium Salt PromegaE1601
SpectraMax i3 Molecular DevicesFluorescence Plate Reader
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco15250061
ZO-1 Polyclonal Antibody ThermoFisher61-7300
anti-GAPDH antibodyabcamab8245
Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L)Jackson ImmunoResearch Inc128817
12-well, Flat BottomOlympus Plastics25-106
RIPA buffer (5X)Alfa AesarJ62524
AprotininFisher BioReagentsBP2503-10
Odyssey CLx imagerLI-COR Biosciencesfor scanning western blot membranes

Referenzen

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