Amarelo de Lucifer-um marcador Paracellular robusto da permeabilidade em um modelo da pilha do sangue humano-barreira do cérebro

Resumo

Nós apresentamos um ensaio da fluorescência para demonstrar que o amarelo de Lucifer (ly) é um marcador robusto para determinar a permeabilidade transcelulares paracelulares aparente de monolayers da pilha de hcmec/D3, um in vitro modelo da barreira Human do sangue-cérebro. Utilizou-se este ensaio para determinar a cinética de formação de monocamada confluente em células hCMEC/D3 cultivadas.

Resumo

A barreira sangue-cérebro BBB consiste em células endoteliais que formam uma barreira entre a circulação sistêmica e o cérebro para evitar a troca de íons não essenciais e substâncias tóxicas. Junções apertadas (TJ) efetivamente selar o espaço paracelular nas monocamadas resultando em uma barreira intacta. Este estudo descreve um ensaio de fluorescência com base em ly que pode ser usado para determinar o seu coeficiente de permeabilidade aparente (P_app) e, por sua vez, pode ser usado para determinar a cinética da formação de monocamadas confluentes e a junção apertada resultante integridade de barreira em monocamada de hCMEC/D3. Nós demonstramos mais uma utilidade adicional deste ensaio para determinar a integridade funcional de TJ em pilhas transfected. Nossos dados do ensaio do_aplicativo ly P mostram que as células hCMEC/D3 semeadas em uma configuração de transpoços efetivamente limitam o transporte de ly paracelular 7 dias-pós cultura. Como uma utilidade adicional do ensaio apresentado, nós igualmente demonstramos que o transfection da nanopartícula do ADN não altera o transporte de ly transcelulares paracelulares em monolayers de hcmec/D3.

Introdução

A barreira hematoencefálica (BBB) é a barreira protetora que limita o afluxo de componentes plasmáticos no tecido cerebral e consiste em células endoteliais cerebrais, juntamente com células de apoio, como pericytes. O papel principal do BBB é servir como uma barreira que sela o espaço entre o sangue periférico e o sistema nervoso central (CNS) para manter a hemostasia do microambiente neural^1,2. As pilhas endothelial capilares do cérebro selam eficazmente a via transcelulares paracelulares através da formação de junções apertadas intercelular (TJs)¹. Esta barreira protetora permite glicose e nutrientes selecionados para entrar no cérebro, enquanto impede a maioria dos íons, substâncias tóxicas e drogas de passar por esta barreira apertada. Aparte de seu papel protetor, a função natural da barreira do BBB levanta um desafio severo no desenvolvimento de sistemas da entrega da droga que visam o CNS.

In vitro modelos de cultura celular do BBB são ferramentas úteis para estudar a sua biologia e para compreender os efeitos do tratamento medicamentoso sobre a integridade da barreira TJ. Nós usamos a linha de pilha endothelial microvascular cerebral humana (hcmec/D3) como um in vitro modelo desde que é um modelo aceitado do endotélio do cérebro humano³ e recapitula muitas funções do BBB humano. hcmec/D3is uma das linhas celulares mais comumente utilizadas para modelar o BBB in vitro^4,5,6,7,8,9. Apesar de seus valores comparativamente baixos de resistência elétrica transendotelial (TEER), uma medida de aperto de barreira, esta linha celular retém a maioria das propriedades morfológicas e funcionais das células endoteliais cerebrais, mesmo como uma monocultura na ausência de células gliais cocultivadas^6,7. A linha celular hcmec/D3 expressa vários marcadores BBB^,incluindo transportadores e receptores ativos até aproximadamente a passagem 35 sem sofrer desdiferenciação com fenótipos instáveis^{6,7,9 ,10,11}. A característica mais marcante da linha celular hcmec/D3 como modelo in vitro BBB é sua capacidade de formar TJs^5,9,11,12. Deve-se notar que, embora os modelos de BBB derivado de células-tronco mostraram maior permeabilidade em muitos estudos em comparação com a linha celular hCMEC/D3 e expressam alguns marcadores BBB, eles ainda estão a evoluir como o modelo de célula BBB mais comum¹³. É importante ressaltar que os modelos BBB derivados de células-tronco permanecem caracterizados em relação aos números máximos de passagem que permitem que as células mantenham fenótipos BBB estáveis¹⁴.

Três métodos primários são comumente usados para determinar a integridade da barreira TJ, incluindo a medida de TEER, medição do coeficiente de permeabilidade aparente (P_app) de pequenas moléculas de traçador hidrófilo como sacarose, inulina, Lúcifer Yellow, etc. e imunocoloração de marcadores moleculares conhecidos de TJs tais como Claudin-5, ZO-1, occludin, etc.⁵. TEER é um método relativamente simples e quantitativo que mede a resistência elétrica através das monocamadas celulares cultivadas em substrato de membrana porosa⁵. No entanto, os valores de TEER podem ser influenciados por variáveis experimentais como a composição do meio de cultura e o tipo de instrumento de medida. Uma provável combinação desses fatores leva a uma ampla distribuição de valores de TEER variando de 2 a 1150 Ω cm² na linha celular hCMEC/D3 cultivada por 2-21 dias¹³. A imunocoloração é um método Visual para determinar a presença de proteínas TJ através da rotulagem da proteína alvo usando anticorpos. No entanto, a imunocoloração envolve uma série de etapas experimentais, incluindo a necessidade de fixar/permeabilizar as células que podem resultar em artefatos experimentais e os sinais fluorescentes podem desaparecer ao longo do tempo. Os fatores acima podem levar a erros subjetivos que afetam a qualidade dos dados.

O foco preliminar deste trabalho é apresentar um ensaio aparente da permeabilidade de ly-based determina a cinética de uma formação confluente do monocamada em pilhas hcmec/D3 cultivadas. Embora outros sistemas avançados de BBB in vitro, tais como sistemas de cocultura, sistemas microfluílicos, sejam imita fisiologicamente mais relevantes com função de barreira significativamente melhorada^15,16,17, o hcmec/D3 a instalação do transwell é um modelo simples e de confiança para estimar a cinética da formação de TJ e para ràpida a tela o efeito de formulações diferentes da droga na função da barreira. Em geral, os valores de P_app são consistentes para vários solutos hidrófilos em monolayers hCMEC/D3. Por exemplo, os valores do_aplicativo P relatados para vários solutos de massa molecular baixa (como sacarose, manitol, ly, etc.) em diferentes modelos de BBB in vitro estão na ordem de 10^-4 cm/min^{5,18,19 , 20}. em nossa instalação experimental, as pilhas endothelial do cérebro são semeadas em uma membrana microporosa colagénio-revestida para o acessório da pilha e a formação do monocamada para imitar a barreira in vivo. O ly adicionado no lado apical é esperado atravessar as junções apertadas intercelular e acumular-se no lado basolateral. As concentrações maiores de LY no lado basolateral indicam uma barreira imatura, não-inteiramente funcional quando umas mais baixas concentrações refletirem o transporte restrito devido à presença de TJs funcionais tendo por resultado uma barreira madura.

LY é um corante hidrófilo com picos de excitação/emissão distintos e evita a necessidade de moléculas de traçador radiomarcar como sacarose, manitol ou inulina. Assim, os valores de fluorescência de LY podem ser usados para calcular diretamente sua permeabilidade paracelular através das monocamada BBB. Também, comparado a muitos corantes comercialmente disponíveis usados em campos biomédicos que sofrem de pequenas mudanças Stokes, como fluoresceina²¹, a mudança Stokes de ly é de cerca de 108 nm com separação espectral suficiente, permitindo assim que os dados de fluorescência ly como um leitura robusta para determinar a permeabilidade paracelular. Nós usamos a mancha ocidental como uma técnica ortogonal para demonstrar mudanças na expressão da proteína apertada do marcador da junção, ZO-1, sobre o tempo da cultura. A expressão ZO-1 detectada via Western blotting é usada para complementar os dados do_aplicativo ly p e, em combinação, esses dados sugerem que as alterações observadas nos valores do_aplicativo ly p são refletivas da formação de uma monocamada com aumento gradual na expressão do marcador de junção apertado, ZO-1.

Como apontado mais cedo, o foco central deste trabalho é demonstrar um ensaio de ly como uma técnica simples para monitorar a formação de um monocamada confluente com junções apertadas funcionais. No entanto, para demonstrar uma utilidade adicional do ensaio desenvolvido, medimos o_aplicativo ly P em monolayers de NANOPARTÍCULAS de DNA-transfected hCMEC/D3. Os ácidos nucleicos podem ser condensados em nanopartículas de polieletrólitos com um diâmetro de 100-200 nm através da interacção ELECTROSTÁTICA entre os grupos de polímeros carregados positivamente e os grupos fosfato negativamente carregados de ácidos nucleicos^{22, 23}. nós nos referimos a esses complexos como nanopartículas de DNA (DNA NPS) em nosso trabalho. Enquanto nossa intenção é transfecção células e expressar a proteína desejada, devemos garantir que as propriedades de barreira das monocamada hcmec/D3 não estão comprometidas. Nossos dados sugerem que um regime padrão do transfection do gene da luciferase de 4 h não mude mensurável a permeabilidade de ly que demonstra a utilidade do ensaio do_app de ly P para determinar mudanças na integridade da barreira de TJ.

Protocolo

cultura da pilha de 1. General hCMEC/D3

1. Ressuscitação de células congeladas
   Nota: todos os experimentos e manutenção da cultura celular foram realizados dentro de uma capa de biossegurança estéril. Meios de cultura, suplementos e reagentes foram comprados como produtos estéreis ou esterilizados através de filtração usando um filtro de membrana de 0,22 μm para evitar a contaminação microbiana.
   1. Adicionar 8,5 mL de solução de colágeno (0,15 mg/mL) em um balão de cultura tecidual (75 cm² área de crescimento; referida doravante como T75) e colocá-lo em uma incubadora (37 ° c, 5% co₂) para 1 h.
   2. Retire a solução de colágeno e lave suavemente o balão com soro fisiológico tamponado por fosfato esterilizado (PBS). Adicione 15 mL de meio de crescimento completo ao balão e deixe na incubadora de CO₂ por 15 min.
      Nota: o meio completo (concentração final) continha o crescimento basal da célula endotelial médio-2 (500 mL) suplementado com soro bovino fetal (5%), penicilina-estreptomicina (1%), hidrocortisona (1,4 μM), ascórbico ácido (5 μg/mL), lipídios quimicamente definidos concentrado (1/100), HEPES (10 mM) e fator de crescimento básico de fibroblastos (1 ng/mL).
   3. Mova um CryoVial de pilhas congeladas de hCMEC/D3 do tanque do nitrogênio líquido e descongele ràpida o tubo de ensaio em um banho de água de 37 ° c (< 1 minuto).
   4. Uma vez que apenas um pequeno floco de gelo é visível, rapidamente aspirar e transferir as células para o frasco contendo meio pré-aquecido. Agitar suavemente o balão para permitir a mistura das células com o meio de crescimento.
   5. Coloque o balão na incubadora (37 ° c, 5% CO₂) e observe as células um microscópio de luz após 2 h para se certificar de que as células estão ligadas.
   6. Uma vez que as células se fixam na parte inferior do balão, retire o meio de crescimento antigo e adicione 10 mL de meio de crescimento pré-aquecido fresco para substituir o dimetilsulfóxido no meio de crescimento antigo²⁴.
   7. Após 24 h, verifique um microscópio de luz para observar as células em forma de eixo e substitua o meio de crescimento antigo com meio de crescimento fresco pré-aquecido.
2. Manutenção da cultura celular
   1. Reabasteça o meio de crescimento a cada outro dia até 100% de confluência. Verific as pilhas o microscópio antes de remover o meio velho do crescimento e igualmente após ter adicionado o meio fresco do crescimento. Tire o balão da incubadora e examine as células hCMEC/D3 em microscópio de contraste de fase para garantir que elas pareçam saudáveis.
      Nota: a maioria das células deve ser anexado à parte inferior do balão, tem uma morfologia em forma de eixo e muitas vezes, refracting luz em torno de suas membranas também é visto. O meio de crescimento deve ser transparente (não nublado) e cor de laranja rosado.
   2. Retire o meio de crescimento antigo do balão e transfira 10 mL de meio fresco pré-aquecido para o balão.
      Observação: o meio deve ser adicionado ao lado superior do balão e não diretamente na superfície das células para evitar afetar o acessório da célula.
   3. Gire o balão de volta na posição horizontal e balanç-o delicadamente diversas vezes e verific pilhas de hCMEC/D3 o microscópio antes de retornar o balão à incubadora (37 ° c, 5% CO₂).
   4. Observe as células um microscópio de luz invertido cada vez antes e depois de manusear as células, tanto durante o trabalho de cultura regular e durante os experimentos. Registre quaisquer alterações visíveis no número da célula ou morfologia no caderno de laboratório.
3. De da pilha
   1. Incubar um novo balão T75 com 8,5 mL de solução de colágeno por 1 h na incubadora (37 ° c, 5% CO₂).
   2. Retire a solução de colágeno e lave suavemente o balão com PBS esterilizado. Adicionar 10 mL de meio pré-aquecido de hCMEC/D3 ao novo balão e colocar o balão na incubadora (37 ° c, 5% CO₂).
   3. Tire o balão da incubadora e examine as células hCMEC/D3 um microscópio de contraste de fase para verificar se as células são 100% confluentes.
   4. Remova o meio de células hCMEC/D3 do frasco contendo células e lave as células hCMEC/D3 com 10 mL de PBS.
      Nota: os FBS adicionados ao meio de crescimento contêm inibidores da protease, como α1-antitripsina e α2-macroglobulina. Estes inibem o processo de tripsinização. Assim, é essencial para lavar as células com PBS para remover vestígios de FBS para evitar a inibição do processo de tripsinização.
   5. Adicione 1 mL de 0,25% de solução de tripsina contendo 0, 2% de EDTA e Trypsinize por 2-5 min na incubadora (37 ° c, 5% CO₂) (bata o balão suavemente nas laterais para ajudar a desprendimento).
      Nota: nunca deixe as células em Trypsin/EDTA por mais de 6 min.
   6. Adicione 10 ml de meio pré-aquecido hcmec/D3 para interromper o processo de tripsinização e ressuscitar a célula hcmec/D3 pipetando para cima e para baixo várias vezes. Em seguida, retire a suspensão da célula inteira do balão para um tubo de 15 mL.
   7. Transfira 1 mL da suspensão celular do tubo de 15 mL para o novo balão com meio fresco pré-aquecido (células de separação 1:10) e devolva o novo balão para a incubadora.
      Nota: antes de transferir para o novo balão, pipeta a suspensão da célula para cima e para baixo várias vezes para minimizar gradientes de concentração celular.

2. chapeamento de pilha

1. Coloc inserções da cultura do tecido com as membranas microporosa (tamanho do pore: 0,4 μm, material: tereftalato do polietileno (animal de estimação)) em uma placa da cultura de 24 poços.
2. Adicionar 400 μL de colágeno tipo I (0,15 mg/mL) em cada inserção de cultura tecidual e incubar por 1 h na incubadora de CO₂ (37 ° c, 5% co₂). Balanç a placa 24-well delicadamente para permitir mesmo espalhar da solução do colagénio sobre a membrana microporosa nas inserções da cultura do tecido.
3. Retire a solução de colágeno e lave suavemente a membrana microporosa com 0,4 mL de tampão PBS 1x.
4. Células hCMEC/D3 da placa com a densidade de 50.000 células/cm² nas pastilhas celulares (15.000 células em 500 μL de meio).
   Nota: a fim de minimizar as diferenças no número de células em cada inserção da cultura do tecido, a suspensão da célula foi ressuspendida com uma pipeta de 10 mL antes de adicionar as células às pastilhas.
5. Coloc a placa 24-well com configuração da cultura do tecido em uma incubadora (° c 37, 5% CO₂) para permitir o acessório e a proliferação da pilha.
6. Incubar a placa durante 7 dias para permitir que as células alcancem 100% de confluência. Remova o meio de crescimento todos os dias e transfira 0,5 mL de mídia fresca pré-aquecida para inserções de cultura de tecidos.
7. Repita o procedimento do chapeamento (etapas 2.2-2.6) em uma placa de 12 poços, em uma placa 48-well e em uma placa 96-well. Use a placa de 12 poços para western blotting para determinar as alterações na expressão de ZO-1. Use a placa 48-well para o transfection do ADN NP. Use a placa 96-well para o ensaio do ATP para determinar a viabilidade da pilha em pilhas transfected.

3. cinética do crescimento celular.

1. Semeie as células em uma densidade de 50.000 células/cm² em uma placa de cultura de tecido de 24 poços revestida com colágeno.
2. Em cada dia do experimento, retire o meio de crescimento e lave suavemente as células duas vezes com 500 μL de 1X PBS. Em seguida, adicione 30 μL de 0,25% de solução de tripsina contendo 0, 2% de EDTA e deixe a placa por cerca de 2-5 min em uma incubadora (37 ° c, 5% CO₂).
   Nota: a formação gradual de monocamada confluente pode afetar a extensão do descolamento celular e é necessário aumentar os volumes de tripsina/EDTA, conforme indicado aqui: 30 μL para 1-5 dias após a semeadura, 60 μL para 6-7 dias após a semeadura e 100 μL para 8-10 dias após a semeadura .
3. Adicionar 470 μL, 440 μL ou 400 μL de meio de crescimento com base no volume de solução de Trypsin/EDTA adicionado na etapa 3,2 para preparar 500 μL de suspensão celular em cada poço.
4. Suspenda as células pipetando para cima e para baixo em cada poço várias vezes e observar as células um microscópio para certificar-se de todas as células são suspensas no meio de crescimento. Se algumas células ainda estão ligadas ao fundo da placa após a pipetagem várias vezes, gentilmente raspar as células usando um raspador de células plásticas para facilitar o descolamento celular.
5. Remova 0,1 mL de suspensão celular de 500 μL de suspensão celular na etapa 3,3 e adicione a um tubo de 1,5 mL. Em seguida, adicionar 0,1 mL de 0,4% trypan solução azul para a suspensão celular e misture bem.
6. Limpe um hemacytómetro com álcool isopropílico a 70%. Adicionar 20 μL de mistura da etapa 3,5 de cada lado no sulco V e localizar os 16 quadrados o microscópio. Os 16 quadrados são considerados como uma grade. Localize duas grades aleatórias em cada lado do hemacytómetro e contar todas as células vivas, não-azuis.
   Nota: as células que apareceram em cor azul de excluído da contagem, < 1% das células manchadas azul em todos os pontos de tempo.
7. Calcule a densidade da célula (células/cm²) com base nas seguintes fórmulas.
   Média n º de células/Grid = (EQ. 1)
   Fator de diluição = (EQ. 2)
   Densidade celular (células viáveis/cm²) =
   
   (EQ. 3)
   Equações 1-3. Células viáveis são o número de células contados em cada grade, número de grades correspondem ao número de grades localizadas o microscópio, volume de mistura de suspensão celular e 0,4% azul de trypan é o volume preparado na etapa 3,5, volume de suspensão celular removida é o volume removido da suspensão da pilha de 500 μL na etapa 3,5, o volume de suspensão da pilha em cada poço é a suspensão da pilha de 500 μL da etapa 3,3, área do crescimento da placa da cultura do tecido é a área do crescimento do único poço na placa de 24 poços.

4. ensaio de permeabilidade aparente amarela Lúcifer (LY P _app )

1. Para determinar o_aplicativo ly P em cada dia após a semeadura, siga as etapas a partir de 4,3. Para a determinação do_aplicativo P em células de hCMEC/D3 transfectadas, adicionar 8,3 μl da formulação de transfecção (Figura 1) misturado com 50 μL de meio de crescimento completo e incubar por 4 h. as formulações de transfecção estão descritas na seção 5.
2. Após o transfection de 4 h, lave delicadamente o lado apical duas vezes usando o amortecedor estéril de 1X PBS para remover toda a mistura residual do transfection. Volumes variados de tampão PBS deixados para trás após a remoção podem afetar a concentração de LY no lado apical. Tome cuidado para garantir que o tampão de PBS residual em inserções de cultura de tecido é completamente removido. Aspirar com cuidado os reagentes residuais e o meio para minimizar o destacamento da pilha.
   Nota: esta etapa é ignorada ao medir a permeabilidade aparente de cada dia (P_app) das células hCMEC/D3.
3. Retire o meio de crescimento e adicione 1,5 mL de tampão de transporte pré-aquecido (37 ° c) (25 mM HEPES, 145 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 0,5 mm MgCl₂, 1 mm NaH₂po₄, 5 mm glucose, pH 7,4) para o lado basolateral.
   Nota: o volume de tampão de transporte em todos os compartimentos basolateral deve ser igual para garantir a precisão do cálculo do coeficiente de permeabilidade.
4. Adicionar 58,3 μL de solução de 20 μM de LY ao lado apical de cada pastilha de transpoços. Salvar 50 μL da solução de 20 μM LY para medições de fluorescência. Após ter removido o amortecedor residual de PBS do lado apical completamente, adicione a solução de LY tão rapidamente como possível para evitar secar pilhas de hCMEC/D3. Assegure volumes exatos de solução de LY no lado apical.
   Nota: para minimizar a deterioração da intensidade da fluorescência LY, a exposição à luz deve ser limitada. Uma vez que o pó LY é reconstituído, a solução deve ser armazenada a 4 ° c, protegida da luz.
5. Incubar em um agitador giratório da placa (37 ° c, 100 RPM) para 60 minutos. Em seguida, remova 30 μL da amostra de LY de cada compartimento apical. Em seguida, transfira a solução de 20 μM LY e as amostras laterais apicais para tubos pré-rotulados e diluir a amostra 10 vezes usando o tampão de transporte.
   Nota: é necessário diluir a solução de 20 μM LY e as amostras laterais apicais porque a alta intensidade de fluorescência destas amostras pode potencialmente sobrecarregar e danificar o detector de fluorescência do leitor de microplacas de fluorescência.
6. Retire 500 μL de cada compartimento basolateral e transfira a amostra para tubos pré-rotulados.
   Nota: as amostras são removidas do transwell separado em pontos de tempo indicados. Os pontos de tempo são cada dia após a semeadura a partir do dia 1 até o dia 10.
7. Prepare uma série de padrões LY para a curva padrão (39, 0 nM, 78,13 nM, 156,25 nM, 312 nM, 625 nM, 1250 nM, 2500 nM).
8. Adicionar 100 μL de cada amostra padrão (em duplicado), apical e basolateral a cada poço em uma placa preta de 96 poços (Figura 1).
   Nota: as placas pretas absorvem a luz e reduzem o cruzamento do fundo e da fluorescência entre poços.
9. Utilize um leitor de microplacas de fluorescência (pontos de ajuste: excitação 428 nm, emissão 536 nm) para medir a intensidade da fluorescência LY para calcular o P_app. Um leitor da placa da fluorescência é usado para este estudo.
10. Calcule os valores de P_app e% ly Recovery conforme descrito no texto do manuscrito.
    Equação 4. Formulae para calcular os valores de P_app .
    Calcule o coeficiente de permeabilidade aparente (P_app) e a recuperação% ly usando as seguintes equações. Deve-se notar que os valores de P_app podem ser calculados com base na massa²⁵ ou concentração de ly.
     Ou
    V_a -volume no compartimento apical
    V_B -volume no compartimento basolateral
    A-a área de superfície da membrana da pastilha do transwell (0,3 cm²)
    M_a0 -a massa inicial no compartimento apical
    ΔM_B/Δt-a alteração da massa ao longo do tempo no compartimento basolateral
    CA0-a concentração inicial no compartimento apical
    ΔC_B/Δt-a alteração da concentração ao longo do tempo no compartimento basolateral.
    A equação 5. Fórmulas para calcular a recuperação de% ly.
    Recuperação (%) = 
    M_AF é a massa no compartimento apical no ponto de tempo final, m_BF é a massa no compartimento basolateral no ponto de tempo final, m_a0 é a massa inicial no compartimento apical. ²⁶ Nota: a massa inicial é calculada com base no volume da solução de 20 μm ly na etapa 4,5. Este experimento sempre foi feito usando células o número de passagem 35 e foi conduzido quatro vezes independentes.

5. depleção de cálcio

1. Retire o meio de crescimento das pastilhas de transpoços e da placa de 12 poços e lave suavemente o lado apical e a placa de 12 poços usando meio livre de cálcio pré-aquecido (médio mínimo essencial de Eagle Spinner (S-MEM)) para remover os íons de cálcio das pastilhas de transpoços e placa de 12 poços.
2. Adicionar 500 μL ou 2 mL de S-MEM 1xmedium pré-aquecido às pastilhas ou placa de 12 poços e incubar durante 24 h na incubadora (37 ° c, 5% CO₂). Após a incubação, retire o meio S-MEM 1x e lave as células uma vez usando o tampão PBS pré-aquecido 1x.
3. Siga os passos 4.4-4.10 descritos na secção 4 para tratamento com LY e passos subsequentes. Siga os passos 8.1.2-8.2.4 descritos na secção 8 para western blotting e passos subsequentes.

6. transfecção

1. Preparação de nanopartículas de DNA (DNA NPs).
   1. Diluir a solução de estoque de plasmídeo gWIZ-Luc em 10 mM de acetato de sódio (NaAc) tampão (pH 5,0) e permitir que a solução de DNA para ficar 10 min à temperatura ambiente (RT).
      Nota: o DNA NP contendo moléculas de DNA predominantemente únicas pode ser preparado em concentrações de DNA 20-40 μg/mL²³. Assim, a solução de estoque de plasmídeo gWIZ-Luc precisa ser diluída. O estoque congelado do plasmídeo de gwiz-Luc precisa de ser descongelado completamente no gelo para minimizar o esforço da temperatura. Vortex suavemente a solução de estoque de DNA diluído para 30 s em um vortexer de bancada padrão definido na posição do botão 3-5.
   2. Calcule as relações N/P desejadas, usadas aqui como um parâmetro numérico para refletir a composição de NP.
      
      Equação 6. Cálculo da relação N/P: a proporção de moles dos grupos amina de polímeros catiônicos aos dos grupos fosfato de DNA. Massa de polímeros catiônicos significa quantidade total pesada de polímero catiônico; (Massa/carga) os _{Polímeros Catiônicos} referem-se ao peso molecular do polímero catiônico (poli (Ethyleneglycol) 5K-Block-polyaspartamide com 48 cadeias laterais de dietilenetriamine (PEG-Det)) normalizadas para o número de aminas primárias carregadas (48) por polímero catiônico ( mol/mol), este valor para o nosso polímero é 306 da; Massa de DNA significa quantidade total de DNA utilizada na formulação obtida multiplicando o volume e a concentração em mg/mL; (Massa/carga) O _DNA refere-se ao peso molecular do DNA normalizado ao número de grupo fosfato por DNA de dupla fita (325 da por nucleobase).
      Nota: a tabela de preparação do DNA NP (tabela 1) contém a receita de formulação para as diferentes amostras testadas em nossos experimentos. O DNA NP foi preparado com uma técnica de titulação rápida. A solução de polímero PEG-DET foi adicionada ao longo das paredes do tubo enquanto segurava o tubo em uma posição horizontal. Em seguida, o tubo foi comutado para uma posição vertical, seguido por rapidamente vortexing na velocidade máxima de 10s. O DNA NP foi autorizado a permanecer por 30 min em RT antes do uso. A regra de polegar para dosagem de DNA NP é 0,5 μg de DNA para ca. 1 cm² área de crescimento. Assim, para cada inserção do transwell/cada poço em uma placa 48-well/cada poço em uma placa 96-well, prepare o ADN NP em N/P 10 que contem 0.157/0.5/0.195 μg/poço do ADN de gWIZ-Luc.
   3. Para amostras contendo concentração indicada de POLOXAMER P84 (P84), adicionar P84 ao DNA NP e Vortex por 5 s. A concentração final de P84 em cada amostra é de 0, 1% ou 0, 3% de peso.
2. Transfection do ADN NP em uma instalação da placa 48-well
   1. Semeie as células com a densidade de 50.000 células/cm² em uma placa de poço 48 e cresça até confluência na incubadora (37 ° c, 5% co₂).
   2. Para cada grupo de tratamento, misturar 25 μL da amostra indicada (formulação de transfecção) e 150 μL de meio de crescimento completo e 175 μL desta mistura para cada poço.
   3. Observe as células hCMEC/D3 um microscópio para garantir que as células pareçam saudáveis e sejam 100% confluentes no momento do experimento.
   4. Retire o meio de crescimento de poços e 175 μL de mistura de transfecção para cada poço. Em seguida, incubar a placa por 4 h na incubadora (37 ° c, 5% CO₂).
   5. Após 4 h, retire a mistura de transfecção e lave as células hCMEC/D3 com tampão PBS estéril pré-aquecido 1x.
      Nota: para minimizar o descolamento acidental de células hCMEC/D3 da superfície da placa/pastilha durante as etapas de lavagem, cuidadosamente Pipetar PBS estéril suficiente ao longo das paredes dos poços e remover quaisquer nanopartículas nos meios de cultura residuais.
   6. Agitar suavemente a placa algumas vezes e aspirar cuidadosamente e descartar a lavagem PBS e adicionar 500 μL de hCMEC/D3 meio de cultura pré-aquecido.
   7. Examine microscopically as pilhas e anote observações na morfologia da pilha e em todos os efeitos possíveis do transfection.
   8. Incubar por 24 h na incubadora da cultura de pilha de 37 ° c para permitir a produção do luciferase. Após 24 h, retire completamente o meio de crescimento e lave as células uma vez com 1X PBS pré-aquecido.
   9. Lyse as pilhas transfected adicionando 100 μL do reagente do lysis 1x da cultura de pilha do luciferase do gelo-frio por bem.
   10. Para a medição do teor de proteína luciferase, adicionar 20 μL de lisado celular e 100 μL de tampão de ensaio luciferase (20 mM de glicina (pH 8), 1 mM MgCl₂, 0,1 mm EDTA, 3,5 mm dtt, 0,5 mm ATP, 0,27 mm coenzima A) em um tubo de 1,5 ml.
   11. Leia a luminescência da amostra descrita na etapa 6.2.10 em um luminómetro com um único auto-injector.
       Nota: a luminescência deve ser integrada ao longo de 10 s antes da leitura.
   12. Meça a quantidade total de proteína celular no lisado usando um jogo do ensaio do ácido ácido (ensaio de BCA) seguindo o protocolo do fabricante.
   13. Calcule e expresse a expressão do gene do luciferase como unidades claras relativas (RLU) por a proteína celular total.

7. ensaio luminescente ATP

1. Semeie as células com a densidade de 50.000 células/cm² em uma placa de poço 96 e cresça até confluência na incubadora (37 ° c, 5% co₂).
2. Transfect as pilhas com 9,7 μL da formulação do transfection (os detalhes da preparação estão na seção 6) e 58,4 μL do meio completo do crescimento para 4 h.
3. Remova a mistura do transfection e lave delicadamente as pilhas com o amortecedor pre-aquecido de PBS 1x duas vezes para remover completamente os reagentes do tratamento.
   Nota: os diferentes volumes de tampão residual podem diluir os reagentes do ensaio ATP para uma extensão diferente e podem potencialmente afectar os dados.
4. Misturar 75 μL de meio pré-aquecido fresco e reagente de ensaio ATP numa diluição de 1:1 utilizando uma pipeta multicanal. Certifique-se de que o nível de líquido em todas as pontas de pipeta multicanal é o mesmo.
5. Coloc a placa em um abanador de nutating por 15 minutos na temperatura ambiente. Após 15 min de adição dos reagentes, transfira 60 μL de cada amostra para uma placa branca de 96 poços.
   Nota: as placas brancas são melhores para refletir a luz da saída do que placas claras ou pretas.
6. Pop qualquer bolhas de ar usando uma agulha antes de ler a placa. Leia a placa num luminómetro com um tempo de integração de 1 s. Leia a placa dentro de 20 minutos após a adição de reagentes do ensaio ATP. O sincronismo é crítico para a comparação através das placas diferentes, porque o sinal da luminescência é transiente com uma taxa de deterioração rápida.
7. Calcule o percentual (%) viabilidade celular utilizando esta fórmula: (luminescência de células transfectadas/luminescência de controle, células não tratadas) x 100.

8. western blotting para medição de junção apertada proteína ZO-1

1. Lise celular e extração de proteínas
   Nota: todos os passos para a extracção de proteínas das células devem ser efectuados a 2-8 ° c.
   1. Semente as pilhas em uma densidade de 50.000 de pilha/cm² em uma placa colagénio-revestida da cultura do tecido de 12 poços.
   2. No dia 3, dia 5, dia 7, dia 10 pós-semeadura e no dia 7 (células pré-incubadas com meio livre de cálcio), retire o meio de crescimento e lave suavemente as células duas vezes com 2 mL de gelo-frio 1X PBS. Em seguida, adicione 300 μL de mistura de tampão de lise de 1x RIPA gelada contendo 3 μg/mL de aprotinina em cada poço.
      Nota: a mistura deve ser feita na hora e mantida no gelo. A aprotinina é usada para inibir proteases presentes em lisados de degradar a proteína de interesse.
   3. Após dois ciclos Freeze-Thaw (-80 ° c), raspe as pilhas usando um raspador plástico frio da pilha. Colete os lisados de células em tubos de microcentrífuga. Em seguida, centrifugue os tubos a 200 x g durante 30 min a 4 ° c.
   4. Colete o sobrenadante em tubos limpos e coloque-os no gelo. Meça a quantidade total de proteína celular nos lisados usando o kit de ensaio BCA seguindo o protocolo do fabricante.
2. Western blotting para detecção de junção apertada proteína ZO-1
   1. Alíquotas de denature de homogeneatos totais contendo 40 μg de proteína total com tampão de Laemmli 1x a 95 ° c, 5 min e sujeitos a eletroforese em um gel de poliacrilamida de sulfato de sódio de 6-7,5% de redução (SDS-PAGE) (90 V, 10 min através de gel de empilhamento, 120 V através solução de géis).
      Nota: ao carregar as amostras ou padrões, lembre-se de carregar lentamente e cuidadosamente em cada pista, tendo cuidado para não quebrar o poço no processo.
   2. Transfira as proteínas separadas para uma membrana de nitrocelulose com tampão de transferência pH 8,5 que contém 192 mM de glicina, 25 mM TRIS base, 10% metanol e 0,1% SDS (75 V, 110 min à temperatura ambiente).
      Nota: não toque na membrana. Use 70% de fórceps plástico lavado isopropanol para manusear a membrana. A fim transferir com sucesso a proteína ZO-1 (MW 200 kDa) à membrana, o pH deve ser ao redor 8.3-8.5. Se o buffer de transferência é mais ácido do que isso, a transferência não aconteceria. Se as bandas de escada são visíveis ainda sobre o gel, seria útil para aumentar o tempo de transferência e concentração de SDS.
   3. Depois de lavar a membrana usando salina tampão Tris contendo 0,1% Tween 20 (T-TBS), use solução de bloqueio (1:1 LiCOR-Odyssey Block: 1x Tris tampão salina) para bloquear as membranas por 60 min.
   4. Corte cuidadosamente a membrana em duas tiras. Incubar com dois anticorpos primários (anticorpo monoclonal ZO-1, diluição, 1:900, e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) Anticorpo, diluição, 1:10.000) durante a noite a 4 ° c. Em seguida, incubar as membranas ZO-1 e GAPDH com anti-rato de burro IgG (diluição, 1:50000). Após ter lavando as membranas usando T-TBS, imagem as membranas no canal 700 em um Imager de 16 bits.

Resultados

Primeiramente, determinamos o efeito do tempo de cultivo na permeabilidade da LY para determinar a cinética aparente da formação de TJ. Os valores médios do_aplicativo ly P do dia 1 a 10-post de semeadura são mostrados na Figura 2a. No dia 1, a média de P_app foi 4,25 x 10^-4 cm/min e ligeiramente caiu para 3,32 x 10^-4 cm/min no dia 2. O valor médio de P_app aumentou ligeiramente para 3,93 x 10^{-4 ...}

Discussão

Um papel fundamental do BBB é impedir a troca de íons não essenciais e substâncias tóxicas entre a circulação sistêmica e o cérebro para manter a hemostasia do microambiente neural. Uma das características do BBB é a capacidade das células endoteliais capilares para formar junções apertadas (TJs) que efetivamente selar a rota paracelular de transporte. Nós demonstramos um teste de LY P_app como um método quantitativo para determinar a cinética aparente da formação da barreira de TJ em monolay...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
hCMEC/D3 cell line	Cedarlane Laboratories	102114.3C-P25	human cerebral microvascular endothelial cell line
gWizLuc	Aldevron	5000-5001	Plasmid DNA encoding luciferase gene
lucifer yellow CH dilithium salt	Invitrogen	155267
Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes	Falcon	353095
Tissue culture flask	Olympus Plastics	25-207
24-well Flat Bottom	Olympus Plastics	25-107
Black 96-Well Immuno Plates	Thermo Scientific	437111
S-MEM 1X	Gibco	1951695	Spinner-minimum essential medium (S-MEM)
EBM-2	Clonetics	CC-3156	Endothelial cell basal medium-2(EBM-2)
phosphate-buffered saline 1X	HyClone	SH3025601
Collagen Type I	Discovery Labware, Inc.	354236
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23227
Cell Culture Lysis 5X Reagent	Promega	E1531
Beetle Luciferin, Potassium Salt	Promega	E1601
SpectraMax i3	Molecular Devices		Fluorescence Plate Reader
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061
ZO-1 Polyclonal Antibody	ThermoFisher	61-7300
anti-GAPDH antibody	abcam	ab8245
Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L)	Jackson ImmunoResearch Inc	128817
12-well, Flat Bottom	Olympus Plastics	25-106
RIPA buffer (5X)	Alfa Aesar	J62524
Aprotinin	Fisher BioReagents	BP2503-10
Odyssey CLx imager	LI-COR Biosciences		for scanning western blot membranes