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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Diese Methode beschreibt einen lektinbasierten in vitro Sedimentationsassay zur Quantifizierung der Bindungsaffinität von Glucanphosphatase und Amylopektin. Dieser Co-Sedimentations-Assay ist zuverlässig für die Messung der Glucan-Phosphatase-Substratbindung und kann auf verschiedene solubilisierte Glucan-Substrate angewendet werden.

Zusammenfassung

Glucan-Phosphatasen gehören zur größeren Familie der Dual-Spezifity-Phosphatasen (DSP), die Glucansubstrate wie Glykogen bei Tieren und Stärke bei Pflanzen dephosphorylieren. Die Kristallstrukturen der Glucan-Phosphatase mit Modell-Glucan-Substraten zeigen unterschiedliche Glucan-bindende Grenzflächen aus DSP- und Kohlenhydrat-bindenden Domänen. Quantitative Messungen von Glucan-Glucan-Phosphatase-Wechselwirkungen mit physiologisch relevanten Substraten sind jedoch grundlegend für das biologische Verständnis der Glucan-Phosphatase-Enzymfamilie und die Regulation des Energiestoffwechsels. Dieses Manuskript berichtet über einen Concanavalin A (ConA)-basierten in vitro Sedimentationsassay, der entwickelt wurde, um die Substratbindungsaffinität von Glucanphosphatasen gegen verschiedene Glucansubstrate nachzuweisen. Als Proof of Concept wurde die Dissoziationskonstante (KD) der Glucanphosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) und Amylopektin bestimmt. Die Charakterisierung von SEX4-Mutanten und anderen Mitgliedern der Glucan-Phosphatase-Familie von Enzymen demonstriert die Nützlichkeit dieses Assays zur Beurteilung der differentiellen Bindung von Protein-Kohlenhydrat-Interaktionen. Diese Daten zeigen die Eignung dieses Assays zur Charakterisierung eines breiten Spektrums von Stärke- und Glykogen-interagierenden Proteinen.

Einleitung

Glucan-Phosphatasen sind Mitglieder einer funktionell vielfältigen Unterfamilie von Dual-Spezifitäts-Phosphatasen (DSPs) innerhalb der Protein-Tyrosin-Phosphatase (PTP)-Superfamilie1. Sie wurden in den meisten Lebensformen gefunden, einschließlich sehr unterschiedlicher photosynthetischer Organismen, Menschen, Wirbeltieren und einigen wirbellosen Tieren und Protisten 2,3,4. Pflanzen enthalten drei bekannte Glucan-Phosphatasen: Stärkeüberschuss4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) und Like Sex Four2 (LSF2)5....

Protokoll

1. Herstellung von ConA-Sepharose-Kügelchen

  1. Stellen Sie 250 ml eines Bindepuffers her, der 67 mM HEPES (pH 7,5), 10 mMMgCl2 und 0,2 mM CaCl2enthält. Stellen Sie den pH-Wert mit 1 M NaOH-Lösung ein.
  2. Pipettieren Sie 250 μl ConA-Sepharose-Bead-Suspension in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie den Inhalt bei 10.000 x g für 30 s bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand.
    HINWEIS: Für jede für den Assay verwendete Amylopektinkonzentration werden 250 μl ConA-Sepharose-Beads in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen benötigt.
  3. Geben Sie 750 μl des Bindungspuffers in jedes Röhrchen,....

Ergebnisse

Eines der Hauptmerkmale der Glucan-Phosphatase-Proteinfamilie ist ihre Fähigkeit, an Glucansubstrate zu binden. Zunächst wurde die Bindungskapazität von SEX4 an ConA-Sepharose:Amylopektin-Beads mittels SDS-PAGE analysiert (Abbildung 2A). Rinderserumalbumin (BSA) diente als Negativkontrolle, um eine unspezifische Bindung von Proteinen an die ConA-Sepharose:Amylopektin-Kügelchen nachzuweisen. Die SDS-PAGE-Analyse von Proteinen zeigte das Vorhandensein von SEX4-Protein in der Pelletfraktion.......

Diskussion

Diese Arbeit demonstriert die erfolgreiche Entwicklung eines neuartigen in vitro Sedimentationsassays, der die Bestimmung der Bindungsaffinität von Glucan-Glucan-Phosphatase-Interaktionen ermöglicht. Das Assay-Design nutzt die spezifische Bindung von Lektin ConA an Glucane über die Hydroxylreste der Glukose, um gelöste Kohlenhydratsubstrate indirekt auf Sepharose-Beads einzufangen. Dies ermöglicht die Trennung von gebundenen und ungebundenen Proteinfraktionen durch Zentrifugation und Besti.......

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Studie wurde durch den Preis der National Science Foundation MCB-2012074 unterstützt. Die Autoren danken Dr. Craig W. Vander Kooi vom Department of Biochemistry and Molecular Biology der University of Florida für wertvolle Gespräche und Unterstützung. Die Autoren danken auch Dr. Matthew S. Gentry vom Department of Biochemistry and Molecular Biology der University of Florida für seine Unterstützung. Wir bedanken uns bei Dr. Sara Lagalwar, Vorsitzende des Neurowissenschaftsprogramms des Skidmore College, für die Erlaubnis, den LICOR C-Digit-Blot-Scanner für die Western-Blot-Bildgebung zu verwenden.

....

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRPTherm Fisher ScientificMA1-21315-HRP
Biorad gel electrophoresis and Western blot kitBiorad 1703930
Calcium chlorideSigma-Aldrich208291
C-Digit blot scannerLICOR3600-00Blot scanner
Complete protease inhibitor cocktailSigma-Aldrich11836170001
Concanavalin A-sepharose beadsSigma-AldrichC9017This product contains  in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol 
CentrifugeEppendorf 5425R
GlycineFisher ScientificBP381-5
GraphPad Prism 8.0 softwareGraphPad Version 8.0Data analysis software 
HEPESSigma-AldrichH8651
Image StudioLICOR3600-501Acquisition Software
Magnesium chlorideSigma-AldrichM2670
MethanolFisher ScientificA452SK-4
Sodium dodecyl sulfateFisher ScientificPI28312
Potato amylopectinSigma-AldrichA8515
Precast SDSPAGE GelsGenscriptM00653S
Tris baseFisher ScientificBP154-1
Tween 20Fisher ScientificMP1TWEEN201
Westernsure premium chemiluminescence substrate LI-COR 926-95000

Referenzen

  1. Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism. The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).
  2. Gentry, M. S., et al.

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