Essai de sédimentation basé sur la concanavaline A pour mesurer la liaison au substrat des phosphatases glucanes

Résumé

Cette méthode décrit un essai de sédimentation in vitro à base de lectine pour quantifier l’affinité de liaison de la phosphatase glucane et de l’amylopectine. Ce test de co-sédimentation est fiable pour mesurer la liaison du substrat de la phosphatase glucane et peut être appliqué à divers substrats de glucane solubilisés.

Résumé

Les phosphatases glucanes appartiennent à la grande famille des phosphatases à double spécificité (DSP) qui déphosphorylent les substrats de glucanes, tels que le glycogène chez les animaux et l’amidon chez les plantes. Les structures cristallines de la phosphatase glucane avec des substrats de glucane modèles révèlent des interfaces distinctes de liaison au glucane constituées de domaines DSP et de liaison aux glucides. Cependant, les mesures quantitatives des interactions de la phosphatase glucane-glucane avec des substrats physiologiquement pertinents sont fondamentales pour la compréhension biologique de la famille des enzymes phosphatases glucane et la régulation du métabolisme énergétique. Ce manuscrit rapporte un essai de sédimentation in vitro basé sur la concanavaline A (ConA) conçu pour détecter l’affinité de liaison au substrat des phosphatases glucanes contre différents substrats de glucanes. Comme preuve de concept, la constante de dissociation (K_D) de la phosphatase glucane Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) et de l’amylopectine a été déterminée. La caractérisation des mutants SEX4 et d’autres membres de la famille des enzymes phosphatases glucane démontre une fois de plus l’utilité de ce test pour évaluer la liaison différentielle des interactions protéine-glucides. Ces données démontrent la pertinence de ce test pour caractériser une large gamme de protéines interagissant avec l’amidon et le glycogène.

Introduction

Les phosphatases glucanes sont membres d’une sous-famille fonctionnellement diversifiée de phosphatases à double spécificité (DSP) au sein de la superfamille¹ de la protéine tyrosine phosphatase (PTP). Ils ont été trouvés dans la plupart des formes de vie, y compris les organismes photosynthétiques très divergents, les humains, les vertébrés et certains invertébrés et protistes ^2,3,4. Les plantes contiennent trois phosphatases glucanes connues : Starch Excess4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) et Like Sex Four2 (LSF2)

Protocole

1. Préparation des billes de ConA-Sepharose

1. Fabriquer 250 mL d’un tampon liant contenant 67 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl 2 et 0,2 mM CaCl₂. Ajuster le pH à l’aide d’une solution de NaOH 1 M.
2. Pipeter 250 μL de suspension de billes ConA-Sepharose dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Centrifuger le contenu à 10 000 x g pendant 30 s à 4 °C. Jetez le surnageant.
   REMARQUE : 250 μL de billes de ConA-Sepharose dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL sont nécessaires pour chaque concentration d’amylopectine utilisée pour le dosage.
3. Ajouter 750 μL du tampon de liaison à chaque tube contenant 25....

Résultats

L’une des principales caractéristiques de la famille des protéines de la phosphatase glucane est leur capacité à se lier aux substrats de glucanes. Tout d’abord, la capacité de liaison de SEX4 aux billes de ConA-Sepharose:amylopectine a été analysée à l’aide de SDS-PAGE (Figure 2A). L’albumine sérique bovine (BSA) a servi de témoin négatif pour détecter toute liaison non spécifique des protéines aux billes ConA-Sépharose:amylopectine. L’analyse SDS-PAGE des protéin.......

Discussion

Cette étude démontre le développement réussi d’un nouveau test de sédimentation in vitro qui permet de déterminer l’affinité de liaison des interactions glucane-glucane phosphatase. La conception du dosage tire parti de la liaison spécifique de la lectine ConA aux glucanes via les résidus hydroxyles du glucose pour capturer indirectement les substrats glucidiques solubilisés sur les billes de sépharose. Cela permet la séparation des fractions protéiques liées et non liées par.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP	Therm Fisher Scientific	MA1-21315-HRP
Biorad gel electrophoresis and Western blot kit	Biorad	1703930
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	208291
C-Digit blot scanner	LICOR	3600-00	Blot scanner
Complete protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	11836170001
Concanavalin A-sepharose beads	Sigma-Aldrich	C9017	This product contains  in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol
Centrifuge	Eppendorf	5425R
Glycine	Fisher Scientific	BP381-5
GraphPad Prism 8.0 software	GraphPad	Version 8.0	Data analysis software
HEPES	Sigma-Aldrich	H8651
Image Studio	LICOR	3600-501	Acquisition Software
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M2670
Methanol	Fisher Scientific	A452SK-4
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	PI28312
Potato amylopectin	Sigma-Aldrich	A8515
Precast SDSPAGE Gels	Genscript	M00653S
Tris base	Fisher Scientific	BP154-1
Tween 20	Fisher Scientific	MP1TWEEN201
Westernsure premium chemiluminescence substrate	LI-COR	926-95000