Method Article
In dieser Arbeit präsentieren wir eine longitudinale Auswertung von Goldhamstern, die intraperitoneal (IP) oder intragingival (IG) mit L. infantum-Luc infiziert wurden, mittels biolumineszierender Bildgebung und mittels PCR. Hamster wurden 1 Tag nach der Infektion (1 dpi), 1 Woche nach der Infektion (8 dpi) und 3 Wochen nach der Infektion (22 dpi) untersucht und bei der 50. dpi und 8 Monate nach der Infektion euthanasiert.
Die amerikanische tegumentäre Leishmaniose (ATL) und die viszerale Leishmaniose (VL) werden von der Weltgesundheitsorganisation als vernachlässigt angesehen. VL kann tödlich sein, wenn es nicht behandelt wird; Die zur Behandlung verwendeten Medikamente sind giftig, und es gibt Fälle von Resistenzen. Präklinische Tests können je nach Tiermodell, verwendetem Stamm und Inokulumweg einen Engpass bei der Entdeckung neuer Medikamente für die Behandlung darstellen. Der Goldhamster zeichnet sich durch seine hohe Anfälligkeit für die Untergattungen Viannia und Leishmania aus und zeigt viele der klinischen und immunpathologischen Prozesse, die bei menschlichen Krankheiten beobachtet werden.
Aufgrund der Hamsteranatomie, die einen kurzen Schwanz und kurze Gliedmaßen hat, ist der intrakardiale Weg in der Regel die Wahl für die intravenöse Injektion von Leishmanien. Es handelt sich jedoch um ein Inokulum, das zu Blutungen und schließlich zum Tod von Tieren führen kann. Daher haben wir einen alternativen intravenösen Impfweg für die Infektion an der Zahnfleischvene standardisiert, der minimalinvasiv ist, einen einfachen venösen Zugang ermöglicht und nur wenige lokale und systemische Verletzungen des Tieres verursacht. Daher wurden Hamster, die intraperitoneal (IP) oder intragingival (IG) mit Leishmania Infantum infiziert waren, die Luciferase (Luc) exprimierten, 22 Tage lang mit dem Biolumineszenz-Bildgebungssystem und 50 Tage und 8 Monate nach der Infektion mittels PCR nachbeobachtet.
Nach gingivaler Inokulation sowohl von axenischen Amastigoten als auch von Promastigoten von L. infantum-Luc war die Biolumineszenz an der Injektionsstelle für mindestens 2 Wochen eingeschränkt, was ein Indikator für eine Infektion im Gewebe um den Zahnfleischplexus ist. Hamster, die intraperitoneal mit L. infantum-Luc infiziert waren, zeigten erwartungsgemäß eine über den gesamten Abdomen verteilte Biolumineszenz. Durch das Biolumineszenz-Bildgebungssystem ging die Infektion jedoch bis zum 50. dpi zurück und war nur noch mittels PCR nachweisbar. Axenische Amastigoten zeigten eine bessere Infektion als Promastigoten, wie mittels PCR festgestellt wurde. Tatsächlich wurden 8 Monate nach der Infektion Parasiten mittels PCR in der Leber von Tieren nachgewiesen, die intravenös mit axenischen Amastigoten geimpft worden waren, was ein Merkmal für den Referenzstamm von L. infantum MHOM/BR/1974/PP75 sein kann, dessen Infektion langsam fortschreitet und eine geringe Parasitenlast unterhalb der biolumineszenten Bildgebungsauflösung aufweist. Daher können axenische Amastigoten eine bessere Wahl für die Infektion und Nachsorge sein als Promastigoten, und das gingivale Inokulum ist ein praktikabler Weg für die intravenöse Injektion von Leishmanien und anderen Krankheitserregern.
Die Leishmaniose gilt als vernachlässigte und wieder auftretende Krankheiten, die durch mehr als 20 Leishmanienarten verursacht werden, die in mehreren Ländern in den vier zentralen ökoepidemiologischen Regionen Lateinamerika, Nord- und Ostafrika sowie West- und Südostasien endemisch sind1. Sie können als tegumentäre (TL) und viszerale Leishmaniose (VL) gruppiert werden, die tödlich verläuft, wenn sie nicht behandelt wird. Der ätiologische Erreger von VL in Brasilien ist Leishmania infantum, und die Behandlung wird mit pentavalenten Antimonialen oder Amphotericin B durchgeführt. Diese Arzneimittel werden intravenös verabreicht, haben eine hohe Toxizität, zeigen Nebenwirkungen und es gibt Fälle von Resistenz2.
Daher ist es notwendig, in die Suche nach neuen Chemotherapien zu investieren. Präklinische Tests sind in der Tat ein Engpass bei der Entdeckung neuer Medikamente für die VL-Behandlung, abhängig vom Tiermodell, dem verwendeten Stamm, dem Inokulumweg und anderen logistischen, technischen und betrieblichen Faktoren. Der Goldhamster zeichnet sich durch seine hohe Anfälligkeit für Arten der Untergattungen Viannia und Leishmania aus und zeigt viele der klinischen und immunpathologischen Prozesse, die bei der menschlichen Krankheit beobachtet wurden, wie sie in früheren Studien mit Leishmania braziliensisbeobachtet wurden 3,4. Der mit L. infantum infizierte Hamster entwickelt auch die meisten immunpathologischen Prozesse, die für VL bei Menschen und Hunden charakteristisch sind5, wie Anämie, Leukopenie, Thrombozytopenie und Hepatosplenomegalie. Darüber hinaus ist der Goldhamster ein ausgezüchtetes Tier und zeigt keine einheitliche Reaktion, was die Heterogenität der klinischen Manifestationen reproduziert, wie sie beim Menschen beobachtet wird3.
Ein weiterer Aspekt, der für den Infektionsverlauf zu berücksichtigen ist, ist der Stamm von L. infantum und der Weg der Inokulation. Mehrere Stämme von L. infantum unterscheiden sich im genetischen Hintergrund und in der Anfälligkeit für die Behandlung 2,6,7. Einige Stämme weisen nach einer Promastigoteninfektion eine geringe parasitäre Belastung in Leber und Milz auf8, und axenische Amastigoten können eine Alternative zur Verbesserung der Infektion sein, die noch nicht viel erforscht ist. In der Tat begünstigt der intravenöse Weg die Infektion und erhöht die Häufigkeit von Tieren mit klinischen Symptomen; Die intraperitoneale Inokulation wird jedoch am häufigsten verwendet. Der intrakardiale Weg ist die Wahl für eine intravenöse Infektion mit L. infantum 5,8,9. Bei Hamstern ist die intragingivale Inokulation jedoch ein alternativer Weg zur intravenösen Injektion, der nicht als Infektionsort beschrieben wird. Trotz der Berichterstattung ist die gingivale Venenpunktion minimalinvasiv, ermöglicht einen einfachen venösen Zugang und verursacht nur wenige lokale und systemische Verletzungen10. Die Zahnfleischvenenpunktion stimmt am ehesten mit den Empfehlungen überein, die Qualität und Anwendbarkeit der Ergebnisse bei gleichzeitiger Erhaltung des Wohlbefindens der Tiere zu maximieren11.
Die präklinische Bewertung von Verbindungen für VL mit herkömmlichen Methoden erfordert mehr Tiere, die für die histopathologische Analyse und die Beurteilung der Parasitenlast im Gewebe euthanasiert werden müssen. Im Gegensatz dazu kann das biolumineszierende Bildgebungssystem präklinische Studien beschleunigen und die Anzahl der Tiere reduzieren. Die biolumineszierenden Stellen in den infizierten Geweben können mehrere Wochen lang in Echtzeit am selben Tier nachverfolgt werden. Mehrere Studien zur Standardisierung dieses wichtigen technologischen Werkzeugs haben seine Anwendung in Studien mit Mäusen gezeigt, die mit Trypanosoma cruzi, Leishmania spp. und Toxoplasma gondii infiziert waren 12,13,14,15. Abhängig von der Parasitenbelastung im Gewebe kann die Biolumineszenz jedoch durch das in vivo Bildgebungssystem unterdetektiert werden, was eine quantitative PCR der betroffenen Organe erfordert. Daher schlagen wir vor, eine Methodik zu entwickeln, die auf der intravenösen Injektion von L. infantum, die Luciferase exprimiert, in die Zahnfleischvene von Goldhamstern für die Nachsorge durch das biolumineszierende Bildgebungssystem und die PCR basiert.
Die Protokolle mit Hamstern folgten den Richtlinien der Ethikkommission des Instituto Oswaldo Cruz/IOC (Zulassung: CEUA/IOC L-015/2022).
1. Klonierung des Firefly-Luciferase-Gens in das Leishmania-Expressionsplasmid
2. Herstellung und Selektion von Leishmania infantum , die Luciferase exprimiert
3. PCR zur Bewertung der genomischen Integration in den ribosomalen Locus der 18S rRNA (ssu)
4. Differenzierung von L. infantum-Luc metacyclischer Promastigote und axenischer Amastigote
5. Tiere
6. Infektion über den intraperitonealen Weg
7. Intravenöse Infektion durch gingivale Inokulation
8. Euthanasie durch Herzpunktion, Ausblutung
9. DNA-Extraktion aus Organen und Geweben
10. Bewertung von Infektionen in Geweben und Organen mittels PCR
11. Hamster-Nachsorge durch in vivo Biolumineszenz-Bildgebung
12. Quantifizierung der Biolumineszenz bei Tieren, die mit L. infantum-Luc infiziert sind
Stabile Expression von Luciferase in L. infantum
Genetisch verändertes L. infantum wurde unter Verwendung des Plasmids der pLEXSY-Linie hergestellt, das sich im ribosomalen Locus der 18S rRNA (ssu) in das Genom von Leishmania integriert, dessen Transkription durch RNA-Polymerase I gesteuert wird. Daher wurden L. infantum-Luc-Klone auf Plasmidintegration in das Genom von Leishmania und auf stabile Expression durch Biolumineszenzemission in vitro untersucht. Der hochexprimierende Klon, der eine Biolumineszenz >120-fach über dem Hintergrund aufweist, wurde für die Bewertung der genomischen Integration mittels PCR ausgewählt. Siehe Abbildung 1 für die Agarose-Gelelektrophorese von PCR-Produkten zur Bewertung der Plasmidintegration in das Genom und der Biolumineszenz-Emission (RLU) von Promastigoten des L. infantum-Luc-Klons. Aus jeder PCR wurden Fragmente der erwarteten Größe erhalten; Ein Produkt von etwa 1,1 kB (5'ssu - UTR1) und ein weiteres von 1,8 kB (Hyg- 3'ssu) wurden aus dem Genom von L. infantum-Luc amplifiziert (Abbildung 1A), was die Integration der Plasmidkassette und des Luciferase-Gens in den SSU-Locus des Genoms von L. infantum bestätigt.
Die Luciferase-Expression von Glühwürmchen wurde auch bei Promastigoten von L. infantum-Luc durch Biolumineszenz-Emission (RLU) im Mikroplatten-Reader untersucht, wie in den Protokollen, Abschnitt 2 beschrieben. Selbst nach mehreren Passagen in Kultur und bei BALB/c-Mäusen für 5 Tage behielt es das Niveau der Biolumineszenz bei; 569,3 ± 19,5 für den Wildtyp-Hintergrund und 59361,9 ± 2673,3 (n = 2) für klonierten L. infantum-Luc (Abbildung 1B). So wurde der L. infantum-Luc-Klon, der stabil Glühwürmchen-Luziferase exprimiert, verwendet, um Hamster über intragingivale oder intraperitoneale Wege zu infizieren.
Intravenöses Inokulum in der Zahnfleischvene
Um die Leishmanien in den Blutkreislauf von Hamstern zu impfen, sollte darauf geachtet werden, dass Venenperforationen, Blutungen und Leckagen des Inokulums minimiert werden. Daher muss die Unterlippe sanft nach unten gezogen werden, um die Zahnfleischvene freizulegen (Abbildung 2A); und es muss eine kleinere 30 G-Nadel verwendet werden, um eine übermäßige Perforation der Vene zu vermeiden. Die Nadel muss mit der Blende nach oben positioniert werden, um sie in einem geeigneten Winkel in die Vene einzuführen (Abbildung 2B). Um sicherzustellen, dass die Nadel in das Gefäß - die Labialvene des Unterkiefers - injiziert wurde, muss der Spritzenkolben nach unten gezogen werden, bis Blut in den Nadelzylinder aspiriert wird (Abbildung 2C). Vor der Nadelentfernung muss mit einem Wattestäbchen leichter Druck ausgeübt werden, um die Blutstillung zu fördern (Abbildung 2D).
Längsschnittauswertung mittels Biolumineszenz-Bildgebung
Hamster, die intraperitoneal (IP) oder intragingival (IG) mit L. infantum-Luc infiziert waren, wurden bis zum 50. dpi nachbeobachtet und mittels Biolumineszenzbildgebung bis 22 dpi ausgewertet (Abbildung 3). Die Bilder wurden 2 Stunden nach einer intraperitonealen Infektion mit 108 Parasiten in der Peritonealhöhle aufgenommen; Die Bilder wurden für ein 30 s oder 1 min Expositions-Binning-Medium aufgenommen. Das Biolumineszenzsignal war bei Amastigoten-infizierten Tieren (4,6 × 105 ± 3,7 × 105) im Abdomen >65-fach intensiver als bei Promastigoten-infizierten Tieren (6,8 × 103 ± 3,8 × 103) (Tabelle 1), was zeigt, dass in vitro differenzierte Amastigoten in der stationären Phase biolumineszierender sind als die metazyklischen Promastigoten und im Ficoll-Kissen gereinigt werden.
Einen Tag nach der Infektion (1 dpi) wurden Biolumineszenzbilder für eine 3-minütige Exposition aufgenommen (Abbildung 3). Bei Promastigoten-infizierten Hamstern gab es eine Abnahme des Biolumineszenzsignals in der Bauchregion um 45 % und bei Amastigoten-infizierten Hamstern einen Rückgang um 70 % (Abbildung 3), was darauf hindeutet, dass Amastigoten in größerem Maße abgebaut wurden als metazyklische Promastigoten (Tabelle 1 und Abbildung 4). Eine Woche nach der Infektion (8 dpi) hielten Promastigoten-infizierte Tiere das Biolumineszenzsignal aufrecht (3,3 × 103 ± 5 × 103). Die Biolumineszenz-Emission bei mit Amastigoten infizierten Hamstern sank jedoch um 95 % von 1,3 × 105 ± 1,1 × 105 auf 6,7 × 103 ± 7,5 × 103 (Tabelle 1) und erreichte das gleiche Niveau bei Promastigoten-infizierten Hamstern. Drei Wochen nach der Infektion (22 dpi) wurde ein Biolumineszenzsignal für 5 Minuten Exposition und Binning groß erfasst (Abbildung 3); das Signal war bei Promastigoten und mit Amastigotes infizierten Tieren deutlich geringer (Tabelle 1 und Abbildung 4).
Eine weitere Gruppe von Hamstern wurde über den intragingivalen Weg mit Amastigoten und Promastigoten von L. infantum-Luc infiziert (10,8); Die Biolumineszenzemission wurde im Oberkieferbereich beobachtet (Abbildung 3). Die Nachbeobachtung begann 1 Tag nach der Infektion, und Hamster, die mit Amastigoten infiziert waren, zeigten mehr Biolumineszenzsignal und Strahldichte (7,3 × 103 ± 4,1 × 103) als Promastigoten-infizierte Hamster (1 × 103 ± 5,7 × 102). Eine Woche nach der Infektion (8 dpi) wurde ein Rückgang des Biolumineszenzsignals um 36 % bei mit Promastigoten infizierten Tieren und um 90 % bei den mit Amastigoten infizierten Hamstern beobachtet; Die Strahldichte variierte von 7,3 × 103 ± 4,1 × 103 bis 7,8 × 102 ± 5,6 × 102 (Tabelle 1). Drei Wochen nach der Infektion (22 dpi) wurde auch ein Biolumineszenzsignal für 5 Minuten Exposition und Binning groß erfasst (Abbildung 3). Das Biolumineszenzsignal war für Promastigoten- und Amastigoten-infizierte Tiere im Kopf von Tieren, die an der Gingiva infiziert wurden, ähnlich und gering (Tabelle 1 und Abbildung 4) und es wurde keine Ausbreitung der Infektion in die Bauchregion durch das Biolumineszenzsignal beobachtet.
Bewertung von Infektionen in Geweben und Organen mittels PCR
Wir führten eine konventionelle PCR durch, um Infektionen in bestimmten Organen wie Leber, Milz und Lymphknoten zu untersuchen, die unterhalb der Nachweisgrenze der in vivo-Bildgebung liegen könnten. Die Zielregion der kDNA war spezifischer für die DNA-Amplifikation von L. infantum in infizierten Geweben und Organen, und die PCR für das Enzym GAPDH aus dem Hamster war eine Kontrolle der DNA-Integrität und der PCR-Reaktion. In der Analyse wurden nur die Proben berücksichtigt, die für GAPDH amplifiziert wurden. So zeigten zwei von drei Hamstern, die über den intraperitonealen Weg mit axenischen Amastigoten infiziert wurden, in der PCR eine Infektion in Geweben und Organen; Tier zwei (A2) in der Milz und Tier drei (A3) in der Leber bei 50 dpi (Abbildung 5A). Ein Hamster war intraperitoneal mit axenischen Promastigoten infiziert; Tier drei (A3) (Abbildung 5B) zeigte eine Amplifikation im Lymphknoten. Hamster, die intragingival mit Promastigoten oder axenischen Amastigoten bei 50 dpi geimpft wurden, konnten keine klare Amplifikation aufweisen - nur eine Bande in der Leber von Tier eins (A1), das mit Promastigoten infiziert war (Abbildung 5C). Bemerkenswert ist, dass wir drei Tiere 8 Monate lang gehalten hatten, deren Inokulum auf intragingivalem Weg mit Amastigoten während der Injektion leicht auslief. Zwei von drei Tieren zeigten eine deutliche Infektion in der Leber, die Tiere eins und zwei (Abbildung 5D).
Abbildung 1: Evaluierung des Leishmania infantum-Luc-Klons mittels PCR und Biolumineszenz-Emission. (A) Agarose-Gelelektrophorese von PCR-Produkten zur Bewertung der Plasmidintegration in das Genom: Spur 1 - 1 kb DNA-Leiter; PCR der genomischen DNA von L. infantum-Luc, Spur 2 - 5'ssu - utr1 (1,1 kb) und Spur 3 - hyg- 3'ssu (1,8 kb); PCR der genomischen DNA von L. infantum-wt, Spuren 4 und 5. (B) Biolumineszenz-Emission (RLU) von Promastigoten des L. infantum-Luc-Klons (10,6) im Mikroplatten-Reader. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Intravenöse Injektion von Leishmania infantum-Luc in die Zahnfleischvene. (A) Der Hamster wurde in den dorsalen Dekubitus gelegt und die Unterlippe nach unten gezogen. (B) Eine dünnere Nadel (8 x 0,30 mm), die mit einer 1 ml-Spritze gekoppelt war, wurde unterhalb der unteren Schneidezähne entlang der Mittellinie zwischen dem Zahnpaar in einem Winkel von 25º positioniert und 2-4 mm in die Vena mandibularis labialis eingeführt. (C) Inokulation von 50 μl (10,8) von Amastigoten oder Promastigoten bei PBS. (D) Blutstillung mit einem Wattestäbchen und leichtem Druck auf die Impfstelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Nachsorge durch in vivo Biolumineszenz-Bildgebung. Repräsentative Bilder eines Tieres pro Gruppe: Infiziert über intraperitoneale (obere Felder) oder intragingivale (untere Felder) mit Amastigoten oder Promastigoten von L. infantum-Luc für 1, 8 und 22 dpi. Roter ROI, der die sondierten Regionen am Bauch und am Kopf für eine intraperitoneale bzw. intragingivale Infektion darstellt. Die Daten zeigen, dass alle Tiere bei 1 dpi ein Biolumineszenzsignal im Abdomen oder Unterkiefer zeigten. Das Signal fiel nach 8 dpi ab und war bei 22 dpi in keiner Gruppe mehr nachweisbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Vergleichende Analyse der Strahlung aus Biolumineszenzbildern. Die Quantifizierung der Strahldichte photons.sec-1.cm-2.sr-1 wurde im Bauch oder Kopf von Hamstern mit manuellen ROI-Messwerkzeugen durchgeführt. Der durchschnittliche ROI im Hintergrund wurde vom ROI der Messung abgezogen, um jegliche Fehlsignale zu entfernen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: PCR-Amplifikation von kDNA. (A) IP-AMA, Hamster, die intraperitoneal mit Amastigot infiziert wurden, 50 dpi (n = 3); (B) IP-PRO, intraperitoneal mit Promastigoten infiziert, 50 dpi (n = 3); (C) IG-AMA, intragingival mit Amastigote infiziert (n = 2), IG-PRO, intragingival mit Promastigot infiziert (n = 2); (D) IG-AMA, intragingival mit Amastigot infiziert, 8 Monate nach der Infektion (n = 3). NI, nicht infizierte Hamster als Negativkontrolle (n = 2); C-genomische DNA von L. infantum-Luc, Positivkontrolle der PCR. Gewebe und Organe: 1- Milz, 2- Leber, 3- Lymphknoten. mw- Molekulargewichtsmarkierung, Pfeile zeigen die unteren Molekulargewichtsbanden an. A1 - Tier eins, A2 - Tier zwei und A3 - Tier drei. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
dpi | Amastigotes IP | Promastigotes IP | Amastigotes IG | Promastigotes IG | ||||||||
Bedeuten | SD | N | Bedeuten | SD | N | Bedeuten | SD | N | Bedeuten | SD | N | |
0 | 4,6 x 105 cm | 3,7 x 105 cm | 3 | 6,8 x 103 cm | 3,8 x 103 cm | 3 | - | - | - | - | - | - |
1 | 1,3 x 105 cm | 1,1 x 105 cm | 3 | 3,8 x 103 cm | 5,5 x 103 cm | 3 | 7,3 x 103 cm | 4,1 x 103 cm | 2 | 1,0 x 103 cm | 5,7 x 102 cm | 2 |
8 | 6,7 x 103 cm | 7,5 x 103 cm | 3 | 3,3 x 103 cm | 5,0 x 103 cm | 3 | 7,8 x 102 cm | 5,6 x 102 cm | 2 | 6,4 x 102 cm | 8,2 x 101 cm | 2 |
22 | 7,3 x 101 cm | 8,5 x 101 cm | 3 | 9,9 x 101 cm | 8,6 x 101 cm | 3 | 4,6 x 102 cm | 7,5 x 101 cm | 2 | 5,0 x 102 cm | 1,5 x 102 cm | 2 |
Tabelle 1: Rohdaten aus der vergleichenden Strahlungsanalyse von Biolumineszenzbildern. Quantifizierung der Strahlung durchschnittlicher Photons.sec-1.cm-2.sr-1 nach Gruppe und Route. Abkürzungen: dpi = Tage nach der Infektion; SD = Standardabweichung; N = Stichprobengröße.
Die Blutentnahme oder intravenöse Injektion von Substanzen in Hamster ist für verschiedene wissenschaftliche Studien notwendig. Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um Zugang zu verschiedenen Entnahme- oder Impfwegen zu erhalten, die in direktem Zusammenhang mit den Forschungszielenstehen 19. Aufgrund der Anatomie des Hamsters - ein kurzer Schwanz und kurze Gliedmaßen - ist der intrakardiale Weg in der Regel die Wahl für die intravenöse Injektion von Leishmanien. Je nach verwendetem Stamm erwies sich der intrakardiale Weg als vorteilhaft, da der Referenzstamm L. infantum MHOM/BR/1974/PP75, dessen Infektion über einen längeren Zeitraum von 6-9 Monaten auftritt5. Es handelt sich jedoch um ein Inokulum, das zu Blutungen und zum Tod des Tieres führen kann. Daher haben wir einen alternativen intravenösen Impfweg für die Infektion am Zahnfleischplexus, der Labialvene unterkiefer, standardisiert, der dem Tier weniger Schaden zufügt. Die Tiere wurden mit dem genetisch veränderten Referenzstamm L. infantum MHOM/BR/1974/PP75 infiziert, der auch nach mehreren Passagen in Kultur und bei Mäusen stabil die Glühwürmchen-Luziferase exprimierte (Abbildung 1), wie dies bei anderen Leishmania-Spezies der Fall ist, die mit demselben integrativen Plasmid transfiziert wurden20.
Die Vena mandibularis labialis oder die Vena gingiva ist ein besserer Weg für die Blutentnahme und für die mehrfache Blutentnahme10,11. Dies ist jedoch der erste Nachweis, dass die Zahnfleischvene eine geeignete Stelle für eine intravenöse Infektion durch Leishmanien bei Hamstern ist. Im Gegensatz zur Blutentnahme, bei der normalerweise eine hohe 26-G-Nadel verwendet wird, um eine Bluthämolyse10 zu vermeiden, war diese Nadelstärke aufgrund von Venenperforation, Blutungen und Leckagen des Inokulums nicht für die Leishmania-Impfung geeignet. Bei einer Leishmaniose-Infektion über die Oberkiefervene war eine kleinere 30G-Nadel unerlässlich. Ein weiterer Aspekt, der die Venenpunktion von einer Infektion über die Zahnfleischvene unterscheidet, ist die Verabreichungsrate von etwa 1 μL/s; und um sicherzustellen, dass es in das Gefäß, die Labialvene des Unterkiefers, injiziert wird und nicht in der Schleimhaut, subkutan oder intradermal, eingelagert wird. Aufgrund des geringen Blutumsatzes des Plexus gingivalis mussten die 50 μl eines Inokulums mit hoher Dichte an axenischen Amastigoten oder Promastigoten von L. infantum-Luc, 2 x 109 Parasiten/ml, langsam (~ 1 min) geimpft und die Nadel entfernt werden, indem der Tupfer 1 min lang gedrückt gehalten wurde, um eine Dispersion des Inokulums im Blutkreislauf zu ermöglichen (Abbildung 2).
Für die longitudinale Bewertung der Infektion wurden Hamster intraperitoneal (IP) oder über den intragingivalen (IG) Weg mit L. infantum-Luc infiziert und mit dem Biolumineszenz-Bildgebungssystem bis zur Euthanasie für 50 dpi nachbeobachtet. In Anbetracht der Tatsache, dass der Referenzstamm PP75 per se weniger virulent sein könnte und dass die Superexpression von Luciferase auch die Wirksamkeit der Infektion beeinträchtigen und die Infektion langfristig aufrechterhalten könnte, wurde ein hohes Inokulum von 108 Parasiten für die Infektion verwendet. Nach gingivaler Inokulation sowohl von Amastigoten als auch von Promastigoten von L. infantum-Luc und Auswertung durch das Biolumineszenz-Bildgebungssystem war die Biolumineszenz 24 h nach der Infektion auf den Oberkieferbereich von Hamstern beschränkt. Tatsächlich zeigten Hamster, die intraperitoneal mit Amastigoten und Promastigoten von L. infantum-Luc infiziert waren, eine Biolumineszenz, die über den gesamten Bauch verteilt war (Abbildung 3, 1 dpi). Die kontinuierliche Abnahme der biolumineszenten Emission über den Zeitraum vom ersten Tag der Infektion bis zum 8. Tag und bis zum 22. dpi bei Hamstern, die mit L. infantum-Luc infiziert waren, war unabhängig vom Inokulationsweg (Tabelle 1 und Abbildung 4).
Wenn die Parasitenlast in den tierischen Geweben jedoch gering ist, kann sie unter der Nachweisgrenze des Biolumineszenz-Bildgebungssystems liegen, aber mittels PCR oder qPCR nachgewiesen und quantifiziert werden. Wie bereits berichtet, ist die durch den Stamm PP75 verursachte Infektion in der Tat geringer als die anderer Stämme5, und nur wenige entwickelten aufgrund der genetischen Variabilität der Tiere klinische Krankheitszeichen. In dieser Studie zeigten die axenischen Amastigoten trotz der geringen Anzahl von Tieren und der geringen Virulenz dieses Stammes einen Vorteil bei 50 dpi und zeigten eine bessere Infektion als Promastigoten, wie die PCR zeigte (Abbildung 5). Acht Monate nach der Infektion mit Amastigoten über den gingivalen Weg konnten Parasiten mittels PCR in der Leber nachgewiesen werden (Abbildung 5) und sie zeigten auch eine mäßige Piloerektion, Orbitaenge und gewölbte Haltung.
Axenische Amastigoten können eine bessere Wahl für die Infektion und Nachsorge sein als Promastigoten21 und haben den Vorteil, dass sie in großem Maßstab leicht zu produzieren sind. Das gingivale Inokulum ist durchführbar und ein besserer Weg für die intravenöse Inokulation von Verbindungen und für die Infektion von Leishmanien und anderen Krankheitserregern, ohne Schädigung oder Schwellung an der Applikationsstelle im Mandibül oder für die Tiergesundheit.
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Fundação de Apoio ao Desenvolvimento do Ensino, Ciência e Tecnologia do Estado de Mato Grosso do Sul- FUNDECT. PPSUS/Decit-MS/CNPq/SES hat diese Forschung finanziell unterstützt. Vielen Dank an Monique Ribeiro de Lima für ihre Ratschläge zu den Impfwegen. Dieses Projekt wurde im Rahmen des Kooperationsabkommens Nr. 258/2017 zwischen FIOCRUZ und der Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ entwickelt. Das Team ist den Videoproduzenten Ricardo Baptista Schmidt und Genilton José Vieira vom Science Popularization Center (IOC) herzlich dankbar für ihre unschätzbare Unterstützung und Hilfe beim Filmen der Protokolle und der Durchführung der Interviews.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 kb ladder | Promega | G5711 | |
1-Butanol | Sigma-Aldrich | B7906 | |
Acetyl coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2181 | |
Agarose, LE, Analytical Grade | Promega | V3125 | |
aprt reverse primer A1715 aprt reverse primer A1715 | Jena Bioscience | PM-111 | |
BamHI 10 U/mL | Promega | R6021 | |
BglII 10 U/mL | Promega | R6071 | |
brain and heart infusion (BHI) | Sigma-Aldrich | 53286 | |
Cetamin (Ketamine hydrochloride 10%) | Syntec | - | Veterinary use. Anesthetic. Injectable solution containing a 10 mL vial of 10% ketamine hydrochloride. |
Dextrose Glucose, BD Diagnostics | Difco | 215530 | |
D-luciferin potassium salt | Promega | E1601 | |
DMEM low glucose | Sigma-Aldrich | D6046 | |
eletroporador Gene Pulser Xcell | BioRad Laboratories | ||
Fetal calf serum (FCS) | vitrocell/embriolife | ||
Ficoll-plaqueTM PLUS | Cytiva | 17144003 | |
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap 1652082 | Bio-Rad | 1652082 | |
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes, 0.4 cm gap 1652081 | Bio-Rad | 1652081 | |
GoTaq Platinum polymerase | Fischer Scientific | 10-966-034 | |
GoTaq DNA Polymerase | Promega | M3001 | |
Hemin powder | inlab | ||
HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H3375 Sigma-Aldrich | |
hyg forward primer A3804 | Jena Bioscience | PM-109 | |
Hygromycin | Sigma-Aldrich | H3274 | |
ISOFORINE | Cristalia | Inhalation solution in packs containing 1 bottle of 100 and 240 mL of isoflurane | |
IVIS Lumina | Perkin Elmer | ISO838N4625 | |
JM109 Competent Cells | Promega | L2005 | |
L- Glutamin | Sigma-Aldrich | G8540 Sigma-Aldrich | |
Lambda DNA/HindIII Marker | Thermo Fischer Scientific | SM0101 | |
L-cystein | Sigma-Aldrich | 168149 Sigma-Aldrich | |
Living Image software | Perkin Elmer | - | |
NotI 10 U/mL | Promega | R6431 | |
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol, 25:24:1 (v/v), Molecular Biology Grade | Sigma-Aldrich | 516726 | |
Phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190 | |
plasmid pLEXSY-hyg2 | Jena Bioscience | EGE-232 | |
Proteinase K | Promega | V3021 | |
QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit | Promega | A9281 | |
Schneider's medium | Gibco | 21720-024 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 Sigma-Al | |
SpectraMax2 microplate reader | Applied Biosystems | ||
ssu forward primer F3001 primer F3001 | Jena Bioscience | PM-105 | |
ssu reverse primer F3002 ssu reverse primer F3002 | Jena Bioscience | PM-104 | |
Steady-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2510 | |
SwaI 10 U/mL | Thermo Scientific | ER1241 | |
T4 DNA ligase 1 U/mL | Promega | M1801 | |
T4 fast ligation system | Promega | M8221 | |
Thermal cycler | Applied Biosystems | Veritiy 96 well plate | |
TRITON X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 Sigma-Aldrich | |
Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) | Difco-BD | 211823 | |
Ventilated racks | Alesco | ||
With Earle′s salts and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, | Merck | M5017 | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up | Promega | A9282 | |
Xilazina (Xylazine hydrochloride 2%) | Syntec | - | Veterinary use. Sedative, analgesic and myorelaxant. Injectable solution containing a 10 mL vial of 2% xylazine hydrochloride. |
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit | Thermo Fischer | 451245 |
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