Die Autoren danken an der BfR (Deutschland), BASF SE (Deutschland), IIVS Inc. (USA), zet-LSL (Österreich) ZEBET für die Teilnahme an Multi-center internationalen Validierungsstudie der Modified EpiDerm SIT (5 ).

I. Tissue Klimaanlage - Tag 0 <ol><li> Nach Erhalt der EpiDerm EPI-200-SIT-Kit, überprüfen Sie alle Komponenten des Kits für Integrität (für Kit Details siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte). </li><li> Für alle drei EpiDerm Gewebe, bereiten ein steriles 6-well-Platte mit 0,9 ml Assay-Medium vorgefüllt. </li><li> Unter sterilen Bedingungen, öffnen Sie den Plastikbeutel mit dem 24-Well-Platte mit den EpiDerm Gewebe und entfernen Sie die sterile Gaze. </li><li> Verwenden einer sterilen Pinzette zu jeder Einsatz mit den EpiDerm Gewebe zu entfernen und den Einsatz in den leeren 24-Well-Platte. In diesem Schritt entfernen Sie alle verbleibenden Versand Agarose, dass an den Außenseiten des Einsatzes haftet durch sanfte Blotting auf sterilem Filterpapier. </li><li> Innerhalb der nächsten 5 Minuten, visuell den Geweben. Verwenden Sie keine defekten Gewebe oder Gewebe, die vollständig mit Flüssigkeit bedeckt sind. </li><li> Mit einem sterilen Wattestäbchen Wattestäbchen sorgfältig trocknen die Oberfläche des Gewebes. Versuchen Sie nicht, das Gewebe direkt berühren - Kapillare Effekte sind ausreichend, um die Feuchtigkeit aus dem Gewebe Oberfläche zu entfernen. </li><li> Nach dem Trocknen der Gewebeoberfläche, Transfer drei Gewebe der oberen Reihe der 6-well-Platten mit 0,9 ml Assay-Medium vorgefüllt. Veröffentlichung Luftblasen unter der Einsätze gefangen. </li><li> Legen Sie die 6-well-Platten, die die Einsätze in den Inkubator für 60 ± 5 min Vorinkubation bei 37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH (relative Luftfeuchtigkeit). </li><li> Am Ende der 60 ± 5 min Vorinkubation Zeitraum speichern, übertragen die Einsätze aus dem oberen Brunnen in den unteren Vertiefungen der 6-Well-Platte. Legen Sie die Platten wieder in den Inkubator (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH) für eine Übernachtung Vorinkubation (18 ± 3 h). </li><li> Platzieren Sie den Rest der Assay-Medium in den Kühlschrank (5 ± 3 ° C). Nach der Übernachtung Vorinkubation, kann der Test Chemikalien für die EpiDerm Gewebe aufgetragen werden. Hinweis: Die Vorinkubation Verfahren kann im Falle einer verspäteten Lieferung Gewebe verkürzt werden (zB wenn Gewebe am Mittwoch anreisen, statt Dienstag). </li></ol> II. Chemische Beanspruchung - Tag 1 <ol><li> Bereiten Sie ein 6-Well-Platte je Testchemikalie, indem die obere Reihe nur mit 0,9 ml pro Vertiefung der Assay-Medium. </li><li> Etwa 5 Minuten vor der geplanten Exposition gegenüber chemischen Stoffen, entfernen Sie die 6-well Platten mit den vorkonditioniert Gewebe aus dem Inkubator. </li><li> Beurteilen Sie die Oberfläche von Geweben und entfernen Sie alle Feuchtigkeit mit sterilem Baumwolle Tipps. </li><li> Kennzeichnen Sie alle 6-Well-Platte Deckel mit dem Testmaterial Codes oder Namen. </li><li> Dosieren Sie das Gewebe mit dem Test-Chemikalien in Intervallen von 1 Minute zu erleichtern Spülen der Testsubstanzen nach der Exposition. Halten Sie die Platten mit dosierten Gewebe in die sterile Haube, bis der letzte Gewebe dosiert wird. </li><li> Um zu testen, flüssige Chemikalien, verzichten 30 ul der Lösung direkt oben auf das Gewebe und setzen Sie die Nylon-Mesh-Gewebe auf der Oberfläche. Wenn nötig, vorsichtig Position des Netzes mit der Glühbirne geleitet Glas Pasteur Pipette. Drücken Sie nicht auf der Gewebeoberfläche. </li><li> Für die Prüfung semisolids, verwenden Sie eine positive Verschiebung Pipette auf 30 ul direkt oben auf das Gewebe zu verzichten. Bei Bedarf verteilt die Chemikalie mit Pasteurpipette zur Deckung der Gewebeoberfläche so viel wie möglich. </li><li> Für feste Materialien, kurz vor der Applikation der Testsubstanz, befeuchten Sie die Gewebeoberfläche mit 25 &amp;mgr; l sterilem DPBS. Dies verbessert die Berührung der Gewebeoberfläche mit der Testchemikalie. Füllen Sie eine 25 mg kalibriert scharfe Anwendung Löffel (oder einem anderen geeigneten Werkzeug) mit ca. 25 mg fein gemahlenes Probenmaterial. Übernehmen Sie die feste Testchemikalie auf der Gewebeoberfläche. Falls erforderlich, eine Glühbirne geleitet Pasteur Pipette, um den Löffel komplett leer. Schütteln Sie die Einsätze, um die Ausbreitung der Feststoff auf der Oberfläche zu verbessern. </li><li> Für Testsubstanzen mit wachsartiger Konsistenz, versuchen Sie, eine flache &quot;Cookie wie&quot; Stück ca. 8 mm Durchmesser in Form und legen Sie es oben auf das Gewebe, die zuvor mit sterilem DPBS benetzt. Zur Verbesserung des Kontaktes zwischen Prüfsubstanz und Gewebe, wiegen Sie die &quot;Cookie&quot; mit einer Edelstahl oder Kunststoff zu helfen. </li><li> Bewerben DPBS als negative Kontrolle und 5% SDS als positive Kontrolle, die Kontrolle Gewebe. </li><li> Nach der Dosierung der letzten Gewebe, übertragen alle Platten für 35 ± 1 Minuten, um die befeuchteten Inkubator (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH). </li><li> Nach dem 35 ± 1 Minuten Inkubation bei 37 ° C entfernen Sie alle Platten aus dem Inkubator. Legen Sie die Platten in die sterile Haube und warten, bis ein Zeitraum von 60 Minuten Exposition gegenüber chemischen Stoffen zum ersten dosiert Gewebe abgeschlossen ist. </li><li> Anschließend starten Sie den Waschvorgang mit der ein Einsatz pro Minute Zeitintervall (zum Versichee, dass die gesamte Belichtungszeit für jeden Einsatz 60 Minuten). </li><li> Verwenden Sie eine Waschflasche, um das Gewebe mit einer sterilen DPBS spülen. Füllen Sie das Gewebe einfügen 15 Mal mit einem konstanten Strom von DPBS und leeren Sie ihn. (Hinweis: für Gewebe mit einer Nylon-Mesh, waschen Sie die Gewebeoberfläche 5 Mal und entfernen Sie das Netz vorsichtig mit der spitzen, scharfen Zangen Danach die restlichen weiter 10 Wäschen). </li><li> Nach dem 15. Spülen mit der Waschflasche, komplett versenken den Einsatz 3-mal in 150 ml DPBS und schütteln, um den Rest des Tests Material zu entfernen. </li><li> Schließlich spülen die Gewebe einfügen einmal von innen und einmal von außen mit einer sterilen DPBS. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges von DPBS aus dem Gewebe durch leichtes Schütteln des Einsatzes und Blotting auf die sterile Löschpapier. </li><li> Übertragen Sie die ausgelöscht Gewebe fügt dem neuen 6-Well-Platte zuvor mit Assay-Medium vorgefüllt. Alle diese Schritte (14-18) muss innerhalb von 1 min für jeden Einsatz durchgeführt werden. </li><li> Nach dem letzten Gewebe gespült, sorgfältig trocknen die Oberfläche jedes Gewebe mit einem sterilen Wattestäbchen Wattestäbchen. </li><li> Inkubieren des Gewebes in den Inkubator für die nächsten 24 ± 2 Stunden (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH). Hinweis: Jeder Test Techniker sollte nicht testen mehr als 6 Testsubstanzen einschließlich der negativen und positiven Kontrollen in einem einzigen Testlauf (set), in der Lage sein zu folgen das Protokoll, wie unten beschrieben </li></ol> III. Medium Austausch - Tag 2 <ol><li> Nach dem 24 ± 2 Stunden nach der Inkubation, übertragen Sie die Einsätze in den unteren Teil der 6-Well-Platte mit 0,9 ml Medium vorgefüllt. Medien aus dem oberen Zeilen können für die Analyse der zusätzlichen Endpunkten (Zytokine, Chemokine etc.) gesammelt werden. Die Analyse der sekundären Endpunkte ist optional. </li><li> Fahren Sie mit dem Post-Inkubation (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH) für weitere 18 ± 3 Stunden. </li></ol> IV. MTT Viability Assay - Tag 3 <ol><li> Label zwei 24-Well-Platten mit dem chemischen Namen oder Codes. Eine Platte wird für die Gewebe-Inkubation mit MTT dienen und die andere für die Extraktion. </li><li> Bereiten Sie die MTT-Lösung durch Auftauen des MTT-Konzentrat (5 mg / ml) und Verdünnung mit dem MTT Verdünnungsmittel. Endkonzentration von MTT-Lösung ist 1 mg / ml. </li><li> Pipette 300 ul MTT-Lösung in jedes Well der 24 Well-Platte. </li><li> Entfernen Sie die 6-well Platten aus Inkubator, trocknen Sie die Unterseite der Einlagen auf einem Löschpapier, und übertragen sie in die 24-Well-Platte vorgefüllt mit MTT. </li><li> Platzieren Sie den 24-Well-Platte in den Inkubator (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH) und Inkubation für 3 Stunden ± 5 min. Strikt an die 3 Stunden halten ± 5 min Inkubationszeit auf Abweichung zwischen verschiedenen MTT Lesungen zu vermeiden. </li><li> Wenn die MTT Inkubation abgeschlossen ist, verwenden Sie eine Saugpumpe vorsichtig absaugen MTT-Medium in allen Bohrungen. </li><li> Füllen Sie den Brunnen mit DPBS und wieder absaugen. Dieser Spülvorgang noch zweimal und stellen Sie sicher, dass die Gewebe trocken sind nach der letzten Aspiration. </li><li> Nach dem Waschen Transfer der Einsätze, um eine neue 24-Well-Platte. Tauchen Sie die Einsätze durch vorsichtiges Pipettieren 2 mL Extraktionsmittel-Lösung (Isopropanol) in jedes einzufügen. Der Pegel wird über den oberen Kanten des Einsatzes steigen, damit Notlaufeigenschaften Gewebe. </li><li> Seal der 24-Well-Platte (zB mit Parafilm oder mit Dichtkissen) zu Extraktionsmittel Verdunstung zu hemmen. Entpacken Sie die MTT aus dem Gewebe, das für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln auf einem Schüttler (ca. 120 rpm). Übernachtung Extraktion ohne Schütteln kann auch verwendet werden. </li><li> Nach der Extraktion Zeitraum abgeschlossen ist, dringen die Einsätze mit einer Injektionsnadel oder Birne Perlen Pasteurpipette und lassen Sie den Auszug in die Brunnen, aus dem das Insert getroffen wird. </li><li> Entsorgen Sie die punktierten einfügen und Pipette die Lösung in der auch oben und unten drei Mal, bis sie homogen ist. </li><li> Für jedes Gewebe, übertragen zwei 200 ul Aliquots der violetten Formazan-Lösung in eine 96-Well-Flachboden-Mikrotiterplatte. Übertragen Sie die Duplikate nach der festen Platte Design in der Tabelle zu dieser Video-Protokoll gegeben. Für Rohlinge verwenden Isopropanol. </li><li> Lesen Sie die optische Dichte (OD) des MTT-Extrakte in einem 96-Well-Platte Spektralphotometer mit einer Wellenlänge von 570 nm (540-580), ohne eine Referenz zu filtern. </li><li> Geben Sie die Ergebnisse in die Tabelle für die automatische Berechnung der Ergebnisse (Abb. 1). </li><li> Ein Testchemikalie &quot;reizend&quot; (R38 oder GHS Kategorie 2) gekennzeichnet werden, wenn die prozentuale Lebensfähigkeit des Gewebes durch MTT-Assay bestimmt ist &lt;50% bezogen auf das negative Kontrolle. Hinweis: MTT ist giftig, so achten Sie darauf, Schutzhandschuhe zu tragen beim Umgang. Schützen MTT und seine sosungen aus Licht, da MTT ist lichtempfindlich. Verwenden MTT-Lösung innerhalb weniger Stunden nach der Zubereitung, weil es im Laufe der Zeit verschlechtert. </li></ol> V. Assay Qualitätskontrollen <ul><li> EpiDerm EPI-200-SIT-Kit Annahmebedingungen: In-vitro-RHE-Modellen sollten einheitliche, qualitativ hochwertige Daten über die Zeit geben, nicht nur bei der Validierung (8). Empfohlene Richtlinien zur langfristigen Assay-Reproduzierbarkeit und Leistung zu gewährleisten sind &quot;vollständige Charakterisierung von Zellen oder Geweben, Probenahme jeder Partie ... für Leistung und regelmäßigen Gebrauch von Kontrollen und Benchmark Chemikalien, um Gewissheit über die Konsistenz der Assay-Leistung bieten&quot; (9) . Neben Assay Akzeptanzkriterien unten dargelegt, ist jede Produktion viel EpiDerm Qualitätskontrolle durch den Hersteller gegen eine zusätzliche Benchmark chemische getestet (1% Triton X-100). Die Belichtungszeit benötigt, um Gewebeviabilität zu 50% (ET-50) für Triton X-100 ist bestimmt zu reduzieren. Für EpiDerm haben Jahresdurchschnitt ET-50-Werte von 5,9 Stunden auf 7,5 Stunden lag. Die Charge zu Charge CV für negative Kontrolle Gewebe (dh die Variabilität in Baseline Lebensfähigkeit) hat unter 7,5% für jedes Jahr seit 1996 gemittelt. Um die ET50 Wert jeder Produktionscharge müssen innerhalb von 2 Standardabweichungen von dem historischen Durchschnitt Triton X-100 ET50 in 1996 (;; geringere Akzeptanz limit = 4.8h oberen Akzeptanz limit = 8.7h dh ET-50 = 6,7 Stunden) gegründet fallen für die Verwendung durch den Hersteller freigegeben werden. </li><li> EPI-200-SIT Assay Akzeptanzkriterium 1: Negative Kontrolle: Die absolute OD der negativen Kontrolle (NC) Gewebe (Behandlung mit sterilen DPBS) im MTT-Test ist ein Indikator für die Lebensfähigkeit des Gewebes im Prüflabor nach Transport und die Lagerung Verfahren und unter bestimmten Bedingungen für die Verwendung erhalten. Der Test erfüllt die Akzeptanz Kriterium, wenn die mittlere OD 570 von der NC Gewebe ist ≥ 1,0 und ≤ 2,5. </li><li> EPI-200-SIT Assay Akzeptanzkriterium 2: Positive Control A 5% SDS (in H 2 O)-Lösung wird als positive Kontrolle (PC) verwendet werden und gleichzeitig mit dem getesteten Chemikalien getestet. Concurrent bedeutet, dass der PC in jedem Assay getestet werden, aber nicht mehr als ein PC pro Testtag erforderlich ist. Die Lebensfähigkeit der positiven Kontrolle sollte innerhalb von 95% Konfidenzintervall der historischen Daten. Der Test erfüllt die Akzeptanz Kriterium, wenn die mittlere Lebensfähigkeit der PC Geweben exprimiert in% der negativen Kontrolle Gewebe beträgt 20%. </li><li> EPI-200-SIT Assay Akzeptanzkriterium 3: Standardabweichung (SD) Die Hautreizung wird aus der mittleren Tragfähigkeit auf 3 Einzel-Geweben bestimmt vorhergesagt und somit die Variabilität der Gewebe repliziert werden sollte akzeptabel niedrig. Der Test erfüllt die Akzeptanz Kriterium, wenn die SD von einzelnen% Gewebe Bewohnbarkeit der 3 gleich behandelt berechnet repliziert ist &lt;18%. </li></ul> Repräsentative Ergebnisse <div style="border:1px #000000 solid; width:100%; padding-bottom:5px;"><img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_2.jpg" alt="Abbildung 2" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_3.jpg" alt="Abbildung 3" /> </div> Abbildung 1 Ergebnisse für 6 Test Artikel, NC und PC-Steuerung erhalten -. Ein Teil der automatisierten Tabellenkalkulation für die Berechnung der Ergebnisse. Testen Sie Chemikalien, die Lebensfähigkeit des Gewebes unter 50% bezogen auf NC reduziert werden als reizend eingestuft. Der Test ist optimiert, um Ergebnisse, die weit genug von der Einstufung cut-off (50% Rentabilität) erhöht so die Stabilität des Assays bieten. <div style="background-image:url(../index_RES_1me8j21/c1vzp1s1_strip23px.png); background-position:0 100%; background-repeat:repeat-x; height:24px; width:100%;"><div style="padding-left:26px; padding-right:4px; padding-top:4px; width:100%;"> Materialien </div></div><img src="/files/ftp_upload/1366/materialstable.jpg" alt="Material-Liste" />

<ol>
	<li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. n. g. r. i. d., Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests.">Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests.</a> ALTEX. 21, 107-114 (2004).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol+-+Assessment+of+the+performance+of+the+optimized+test.">EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test.</a> ATLA. 33, 351-367 (2005).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Skin+Irritation+Test:+Improving+the+Sensitivity+of+the+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol.Accepted+for+publication.">In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication.</a> ATLA. , (2009).</li><li>Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ECVAM+International+Validation+Study+on+In+Vitro+Tests+for+Acute+Skin+Irritation:+Report+on+the+Validity+of+the+EPISKIN+and+EpiDerm+Assays+and+on+the+Skin+Integrity+Function+Test.">The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test.</a> ATLA. 35, 559-601 (2007).</li><li>Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Sch&#228;fer, M. R., Sch&#228;fer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follow-up+validation+of+the+modified+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+(SIT):+results+of+a+multicentre+study+of+twenty+reference+test+substances.">Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances.</a> , (2008).</li><li>United Nations. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). , (2007).</li><li>ESAC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. , (2008).</li><li>Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Issues+and+answers.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).</li><li>Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Current+practice.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).</li></ol>

The authors are employees of MatTek corporation which produce reagents and tools used in this article.

In diesem Video haben wir die EpiDerm Test auf Hautreizung (EpiDerm SIT) entwickelt und validiert für die in vitro Hautreizungen Prüfung von Chemikalien, darunter kosmetische und pharmazeutische Wirkstoffe nachgewiesen. Bei der Durchführung dieser Methode ist es wichtig, in aseptischen Bedingungen zu arbeiten und sich streng an den validierten Protokoll, da Abweichung vom Protokoll unterschiedlichen Ergebnissen führen können. Einige Modifikationen des Tests sind möglich, jedoch sollten Änderungen an dem Protokoll direkt mit den Autoren diskutiert werden. Die einzige Einschränkung dieser Methode ist, eine mögliche Störung der Testsubstanz mit dem MTT-Endpunkt. Eine farbige Prüfsubstanz oder eine, die direkt reduziert MTT (und damit imitiert Dehydrogenase-Aktivität der Mitochondrien) können mit dem MTT Endpunkt stören. Allerdings sind diese Testsubstanz nur ein Problem, wenn zum Zeitpunkt des MTT-Test (dh 42 Stunden nach der Testsubstanz Exposition) ausreichende Mengen der Testsubstanz sind immer noch auf den heutigen (oder in) der Gewebe. Bei dieser unwahrscheinlichen Fall, die (wahre) metabolische MTT-Reduktion und der Beitrag durch eine farbige Testmaterial oder (false) direkten MTT-Reduktion durch das Testmaterial kann durch ein Verfahren im Detail in dem Test Standard Operation Procedure bereitgestellt durch beschrieben quantifiziert werden MatTek Corp

an in vitro skin irritation test (sit) using the epiderm reconstructed human epidermal (rhe) model

Die EpiDerm Test auf Hautreizung (EpiDerm SIT) wurde entwickelt,<sup&gt; (1,2,3)</sup&gt; Und validiert<sup&gt; (4,5)</sup&gt; Für<em&gt; In-vitro-</em&gt; Hautreizungen Prüfung von Chemikalien, darunter kosmetische und pharmazeutische Wirkstoffe. Die EpiDerm SIT nutzt die 3D-<em&gt; In-vitro-</em&gt; Rekonstruierten humanen epidermalen (RHE) Modell EpiDerm. Das Verfahren in diesem Protokoll beschriebenen ermöglicht Diskriminierung zwischen Reizstoffe der Kategorie 2 des GHS-und Nicht-Reizstoffe<sup&gt; (6)</sup&gt;. Der Test wird im Laufe eines 4 Tage Zeitraum durchgeführt, bestehend aus Vor-Inkubation, 60 Minuten Exposition, 42 Stunden post-Inkubation und MTT-Assay Lebensfähigkeit. Nach Erhalt Gewebe und Übernachtung Vorinkubation (Tag 0), sind Gewebe topisch auf die Prüfsubstanz (Tag 1), die flüssige, halbfeste, feste oder Wachs werden ausgesetzt. Drei Gewebe sind für jede Testchemikalie, sowie für die positive Kontrolle (5% aq. SDS-Lösung), und eine negative Kontrolle (DPBS) verwendet. Chemische Belastung dauert 60 Minuten, 35 min, von denen das Gewebe in einem Inkubator bei 37 ° C gehalten Die Testsubstanzen werden dann von der Gewebeoberfläche durch ein umfangreiches Waschvorgang entfernt. Das Gewebe-Einsätze sind ausgelöscht und in frischem Medium. Nach einem 24 Stunden Inkubationszeit (Tag 2), ist das Medium ausgetauscht. Das Medium kann für die weitere Analyse von Zytokinen oder anderen Endpunkte von Interesse gespeichert werden. Nachdem das Medium austauschen, sind Gewebe für weitere 18 Stunden inkubiert. Am Ende des gesamten 42h post-Inkubation (Tag 3), sind die Gewebe in gelben MTT-Lösung überführt und für 3 Stunden. Der resultierende violett-blauen Formazan-Salz, vor allem von mitochondrialen Stoffwechsels gebildet wird, ist für 2 Stunden mit Isopropanol extrahiert. Die optische Dichte der extrahierten Formazan wird mit einem Spektralphotometer. Eine Chemikalie wird als reizend, wenn die Lebensfähigkeit des Gewebes in Bezug auf die negative Kontrolle behandelten Gewebe unter 50% reduziert eingestuft. Dieses Verfahren kann als voller Ersatz der in vivo Kaninchen auf Hautreizungen getestet Gefahrenerkennung und Kennzeichnung von Chemikalien im Einklang mit EU-Vorschriften eingesetzt werden<sup&gt; (7)</sup&gt;.

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An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

In diesem Video zeigen wir die EpiDerm Test auf Hautreizung (EpiDerm SIT) entwickelt und validiert<em&gt; In-vitro-</em&gt; Hautreizungen Prüfung von Chemikalien, darunter kosmetische und pharmazeutische Wirkstoffe.

Ein In Vitro Skin Irritation Test (SIT) mit dem EpiDerm Rekonstruierte Human Epidermal (RHE) Model

The EpiDerm Skin Irritation test (EpiDerm SIT) was developed (1,2,3) and validated (4,5) for in vitro skin irritation testing of chemicals, including ...

an-vitro-skin-irritation-test-sit-using-epiderm-reconstructed-human

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model

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Serie: An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

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Christopher Hughes: Eine In-vitro-Modell für das Studium der Angiogenese (Interview)

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Forschung

Biologie

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Maus Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Kulturen

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Ein Allel-spezifische Gene Expression Assay zur Funktionsanalyse Grundlage genetischer Verbände testen

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imaging C. elegans Embryos mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop und Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Langfristige letale Toxizität Test mit dem Krustentier Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Differenzierung von Newborn Mäusehaut Derived Stem Cells in Germ-like Cells<em&gt; In-vitro-</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and develops most often in the setting of immunosuppression. Despite decades of research, optimal treatment of KS remains poorly defined and clinical outcomes are especially unfavorable in resource-limited settings. KS lesions are driven by pathological angiogenesis, chronic inflammation, and oncogenesis, and various in vitro cell culture models have been developed to study these processes. KS arises from KSHV-infected cells of endothelial origin, so EC-lineage cells provide the most appropriate in vitro surrogates of the spindle cell precursor. However, because EC have a limited in vitro lifespan, and as the oncogenic mechanisms employed by KSHV are less efficient than those of other tumorigenic viruses, it has been difficult to assess the processes of transformation in primary or telomerase-immortalized EC. Therefore, a novel EC-based culture model was developed that readily supports transformation following infection with KSHV. Ectopic expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 allows for extended culture of age- and passage-matched mock- and KSHV-infected EC and supports the development of a truly transformed (i.e., tumorigenic) phenotype in infected cell cultures. This tractable and highly reproducible model of KS has facilitated the discovery of several essential signaling pathways with high potential for translation into clinical settings.

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is a tumor induced by infection with the oncogenic virus human herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). The endothelial cell culture model described here is uniquely suited for studying the mechanisms by which KSHV transforms host cells.

Ein In-vitro- Modell für die Erforschung der zellulären Transformation von Kaposi-Sarkom-Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

Isolierung von Maus epidermalen Keratinozyten und ihrer In-Vitro-Clonogenen Kultur

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and require surgical debridement and skin grafting. Successful integration of the donor graft into a recipient wound bed depends on timely recruitment of immune cells, robust angiogenic response and new extracellular matrix formation. The development of novel therapeutic agents, which target some key processes involved in wound healing, are hindered by the lack of reliable preclinical models with optimized objective assessment of wound closure. Here, we describe an inexpensive and reproducible model of experimental full thickness burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft. The wound is induced on the dorsum surface of anaesthetized inbred wild type mice from the BALB/C and SKH1-Hrhr backgrounds. The burn is produced using a brass template measuring 10 mm in diameter, which is preheated to 80 &#176;C and delivered at a constant pressure for 20 s. Burn eschar is excised 24 hours after the injury and replaced with a full thickness graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse. No specialized equipment is required for the procedure and surgical techniques are straightforward to follow. The method may be effortlessly implemented and reproduced in most research settings. Certain limitations are associated with the model. Due to technical difficulties, the harvest of thinner split thickness skin grafts is not possible. The surgical method we describe here allows for the reconstruction of burn wounds using full thickness skin grafts. It may be used to carry out preclinical therapeutic testing.

The aim of this study was to develop a murine model of burn wound healing. A thermal burn was induced on the dorsal skin of mice using a preheated brass template. Burned tissue was debrided and overlaid with a skin graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse.

Ein murines Modell einer Verbranntenwunde, rekonstruiert mit einem allogenen Hautgraft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...