Bereiten Sie mindestens zwei Stunden vor Beginn des Experiments gemäß den Anweisungen des Herstellers eine Hochdruckgefrier- oder HPF-Maschine vor. Übertragen Sie HPF-Aluminiumträger vom Typ A in ein Zwei-Millimeter-Zentrifugenröhrchen mit einem Milliliter Ethanol und beschallen Sie sie 10 Minuten lang in einem Ultraschallreiniger. Trocknen Sie die Träger in einer Petrischale, die mit hochwertigem Filterpapier bedeckt ist.
Tränken Sie die vorgereinigten Träger in 1-Hexadecen. Nehmen Sie mit einer feinen Pinzette eine vorbereitete Saphirscheibe aus der HeLa-Zellkulturschale. Berühren Sie die beschriftete Oberfläche mit hochwertigem Filterpapier, um das überschüssige Medium zu entfernen.
Montieren Sie die Saphirscheibe in den HPF-Probenhalter und verschließen Sie die Scheibe schnell mit einem 0,025 Millimeter tiefen Aluminiumträger, der 1-Hexadecen enthält. Überschüssige Lösung mit qualitativem Filterpapier absaugen. Beladen Sie den Probenhalter für das Hochdruckgefrieren.
Entladen Sie die Saphirscheibenträgerbaugruppe unter flüssigem Stickstoff in einer Schaumstoff-Kryobox. Bereiten Sie zwei Milliliter der Gefriersubstitutionsfixierung oder FSF-Lösung in einem runden 20-Millimeter-Polypropylenbehälter in einem Abzug vor und frieren Sie ihn mit flüssigem Stickstoff ein. Verwenden Sie eine vorgekühlte Pinzette, um die Saphirscheiben und Trägerbaugruppen in den Behälter mit gefrorener FSF-Lösung unter flüssigem Stickstoff zu laden.
Übergeben Sie diesen Behälter in eine vorgekühlte automatisierte Gefriersubstitutionsmaschinenkammer für die FSF-Verarbeitung bei minus 90 Grad Celsius. Halten Sie die Proben eine Stunde lang bei minus 90 Grad Celsius, trennen Sie dann die Saphirscheiben mit einer vorgekühlten Pinzette von den Trägern und achten Sie darauf, dass die markierten Seiten der Saphirscheiben nach unten zeigen. Halten Sie die Proben weitere 8 bis 10 Stunden bei minus 90 Grad Celsius, bevor Sie sich innerhalb von drei Stunden auf minus 60 Grad Celsius erwärmen.
Ersetzen Sie die FSF-Lösung im Behälter durch vorgekühltes Aceton und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei minus 60 Grad Celsius. Wiederholen Sie diese Acetonwäsche zweimal. Innerhalb von drei Stunden auf minus 30 Grad Celsius erwärmen.
Währenddessen zwei Milliliter FSF-Lösung zwei in einem Zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchen bei minus 30 Grad Celsius vorbereiten und vorkühlen. Ersetzen Sie das Aceton durch FSF-Lösung zwei und inkubieren Sie es drei Stunden lang bei minus 30 Grad Celsius. Ersetzen Sie dann die FSF-Lösung zwei im Behälter durch vorgekühltes Aceton und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei minus 30 Grad Celsius.
Wiederholen Sie diese Acetonwäsche zweimal. Innerhalb von zwei Stunden auf minus 30 bis 4 Grad Celsius erwärmen. Ersetzen Sie das Aceton durch zwei Milliliter 0,2 molaren HEPES-Puffer.
Wechseln Sie den Puffer einmal und inkubieren Sie ihn bei Raumtemperatur oder vier Grad Celsius über Nacht.
